检测preS/S区缺失情况的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测preS/S区缺失情况的引物及试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括一对检测HBV基因组preS/S区缺失情况的引物PS‑F2和PS‑R1，所述引物PS‑F2的核苷酸序列为：5’‑CATTTTGBGGGTCACCATATTC‑3’；所述引物PS‑R1的核苷酸序列为：5’‑AAAACMCCGCCTGTAACACG‑3’。该引物择preS/S区保守序列进行引物设计，检测结果与测序结果准确率高达100％，可同时检测preS/S区野生型和缺失型；包含该引物的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

Primers and kits for detection of preS/S deletion

【技术实现步骤摘要】
检测preS/S区缺失情况的引物及试剂盒
本专利技术属于体外核酸检测领域，具体涉及一种检测preS/S区缺失情况的引物及试剂盒。
技术介绍
原发性肝癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)约占85％。国际癌症研究署(IRAC)2012年估计世界约有78.2万例新发肝癌病例，74.6万例肝癌死亡，其中新发肝癌例数中国占50.5％，肝癌死亡例数占51.3％。2014年我国肿瘤数据显示，新发肝癌例数36.5万，死亡数约31.9万，在男性新发恶性肿瘤中，位居第三位，在女性新发恶性肿瘤中，位居第七位；在男性所有恶性肿瘤死亡中，肝癌死亡占16.12％，位居第二位，在女性所有恶性肿瘤死亡中，肝癌死亡占10.07％，位居第三位。肝癌是严重危害中国人生命健康的最主要癌症之一，是亟需解决的重大公共卫生问题。肝癌的发生是一个多因素多阶段的过程，包括环境因素：慢性肝炎病毒(HBV/HCV)的感染，饮用水污染以及饮食中黄曲霉素的摄入，平时不良的生活习惯(吸烟、喝酒)等，其中乙型肝炎病毒HBV感染导致的肝癌占60％以上。乙肝患者慢性感染5年后，有10-20％的患者将发展为肝硬化，6-15％的慢性肝硬化病人和乙肝患者会发展为肝癌。《EASL2017ClinicalPracticeGuidelinesonthemanagementofhepatitisBvirusinfection》(2017年EASL临床实践指南：HBV感染的管理)中明确指出HBVDNA的特殊突变与HCC发生风险相关。《Updateonprevention,Diagnosis,andTreatmentandofChronicHepatitisB:AASLD2018HepatitisBGuidance》(美国肝病协会HBV管理指南2018年)中明确指出HBsAg突变会导致检测HBsAg假阴性，而研究表明preS/S的突变会导致HBsAg表达异常。因此检测HBV基因组突变有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。HBV病毒复制过程无校对机制，在慢性感染的过程中发生基因突变的概率很高，预计每年病毒一个核苷酸突变发生率为1.4-3.2×10-5，因此1000个HBV病毒每年有44.8-102.4个核酸发生突变。突变可导致宿主免疫识别的病毒抗原表位改变，病毒免疫逃逸；病毒HBVDNA复制能力增加；产生耐药机制；产生HBsAg假阴性的隐匿性HBV感染性肝炎等系列疾病。HBVDNA突变与肝病向肝纤维化、肝癌的疾病发展相关。HBV基因组由四个基因区，分别为S，C，P，X区。S区分为前S(preS)/S区，preS/S区负责编码组成HBsAg的小膜蛋白(S)、中膜蛋白(M)、大膜蛋白(L)，preS/S区突变导致HBsAg合成或者组装失败，细胞免疫系统识别不到HBsAg，造成HBV病毒免疫逃逸，病毒持续复制；preS/S区突变导致大量蛋白无法排出肝细胞，造成肝细胞内压力增大，引起细胞内基因组不稳定，进而引起相应慢性肝病的发生，包括肝纤维化、肝癌。目前市面上对于HBV基因组S区缺失的检测方法主要是DNA直接测序法，该方法为行业的金标准，但是检测过程过于复杂、耗时长，并且无法满足大量样本同时检测的要求。并且在野生型和缺失型同时存在时，测序结果会出现异常无法分析，需要制备单克隆挑选大量的克隆子测序验证，整个过程繁琐耗时。还有研究使用毛细管电泳进行preS/S区缺失情况，使用毛细管电泳需要采购专用的仪器设备，仪器设备较贵，需要专业人员进行操作，并且不同的毛细管电泳仪通量不同，在仪器和人工及维护等成本上均较高。使用普通的琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作简单，不需要昂贵仪器，并且可适用于散样和大量样本的同时检测。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种检测HBV基因组preS/S区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物及试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：检测preS/S区缺失情况的引物，包括一对引物PS-F2和PS-R1；所述引物PS-F2的核苷酸序列(SEQIDNO:1)为：5’-CATTTTGBGGGTCACCATATTC-3’；所述引物PS-R1的核苷酸序列(SEQIDNO:2)为：5’-AAAACMCCGCCTGTAACACG-3’。本专利技术还提供了另一种技术方案，检测preS/S区缺失情况的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的检测preS/S区缺失情况的引物。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的检测HBV基因组preS/S区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物，选择preS/S区保守序列进行引物设计，检测结果与测序结果比较准确率高达100％，可同时检测preS/S野生型和缺失型；包含有上述引物的试剂盒，不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。采用该试剂盒进行检测，分析结果简单快捷，准确性高，适用性广，配合阳性对照同时电泳，根据扩增条带的大小进行区分，根据HBV基因组preS/S区的缺失情况预测乙肝患者发生肝癌的风险，有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。附图说明图1所示为本专利技术具体实施方式的preS/S区检测结果示例图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：在常规PCR的基础结合电泳技术来实现preS/S区是否出现缺失的检测。本专利技术的检测preS/S区缺失情况的引物，包括一对引物PS-F2和PS-R1；所述引物PS-F2的核苷酸序列为：5’-CATTTTGBGGGTCACCATATTC-3’；所述引物PS-R1的核苷酸序列为：5’-AAAACMCCGCCTGTAACACG-3’。本专利技术提供的另一种技术方案，检测preS/S区缺失情况的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的检测preS/S区缺失情况的引物。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的检测HBV基因组preS/S区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物，选择preS/S区保守序列进行引物设计，检测结果与测序结果比较准确率高达100％，可同时检测preS/S野生型和缺失型；包含有上述引物的试剂盒，不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。采用该试剂盒进行检测，分析结果简单快捷，准确性高，适用性广，配合阳性对照同时电泳，根据扩增条带的大小进行区分，根据HBV基因组preS/S区的缺失情况预测乙肝患者发生肝癌的风险，有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。进一步的，所述PCR反应液还包括Taq酶、dNTP和UNG酶。从上述描述可知，试剂盒中引入UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定的对样品进行检测。进一步的，所述dNTP的浓度为2.5mM。进一步的，所述检测preS/S区缺失情况的试剂盒，还包括阳性质控品1、阳性质控品2和阴性质控品；所述阳性质控品1为已灭活的HBVpreS/S区无缺失的血清样本；所述阳性质控品2为已灭活的HBVpreS/S区缺失的血清样本；所述阴性质控品为灭菌纯化水。进一步的，所述阳性质控品1和阳性质控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测preS/S区缺失情况的引物，其特征在于，包括一对引物PS‑F2和PS‑R1，所述引物PS‑F2的核苷酸序列为：5’‑CATTTTGBGGGTCACCATATTC‑3’；所述引物PS‑R1的核苷酸序列为：5’‑AAAACMCCGCCTGTAACACG‑3’。

【技术特征摘要】
1.检测preS/S区缺失情况的引物，其特征在于，包括一对引物PS-F2和PS-R1，所述引物PS-F2的核苷酸序列为：5’-CATTTTGBGGGTCACCATATTC-3’；所述引物PS-R1的核苷酸序列为：5’-AAAACMCCGCCTGTAACACG-3’。2.检测preS/S区缺失情况的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的检测preS/S区缺失情况的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括Taq酶、dNTP和UNG酶。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛怡婷，
申请(专利权)人：阿吉安福州基因医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35