固定化转氨酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及固定化转氨酶及其应用，属于制药技术领域。所述固定化转氨酶是ω‑转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体可以是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。所述固定化转氨酶结合牢固、可重复利用次数多。所述固定化酶可以应用于制备氨基化合物，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

Immobilized transaminase and its application

【技术实现步骤摘要】
固定化转氨酶及其应用
本专利技术涉及固定化转氨酶及其应用，属于制药

技术介绍
贝西沙星(besifloxacin)是一种新的用于治疗结膜炎的第四代喹诺酮类抗菌剂；贝西沙星的制备方法中一般需要中间体化合物III：在已知的方法中，使用酶催化羰基化合物得到氨基化合物是比较经济和环保的方法，但已知的酶催化方法中使用的为液体的酶或酶粉，其存在反应体系中因有蛋白质而难以过滤反应液的现象，且滤液中易含有细胞碎片，在萃取分层时易出现乳化现象，此外，因反应使用有机溶剂，易导致酶失活而不能重复套用，这些问题，导致酶催化方法难以在产业化中应用。因而，目前关于贝西沙星中间体化合物III的酶催化制备工艺仍有需要进行改进。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种酶或方法以解决上述现有技术的问题。第一方面，本专利技术提供一种固定化转氨酶，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体可以是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。所述酶固定化载体可以是树脂的各种型号，如所述环氧树脂可以是LX-1000EP或200EP型号或其它型号，所述氨基载体树脂可以是HAA或1000EPN型号或其它型号，所述吸附载体树脂可以是EP120或EP130型号或其它型号，所述离子交换载体树脂可以是T300或LX-1000Q1A型号或其它型号。在一些实施方式中，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于氨基载体树脂、吸附载体树脂或离子交换载体树脂上得到的。在一些实施方式中，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂LX-1000EP或200EP型号、氨基载体树脂HAA或1000EPN型号、吸附载体树脂EP120或EP130型号或者离子交换载体树脂T300或LX-1000Q1A型号。专利技术人使用比活力为975.5U/g的游离ω-转氨酶粗粉，经过本专利技术的方法/方式固定化后得到的固定化转氨酶的比活力约887U/g；所述固定化转氨酶结合牢固、酶活性损失少、分离简单、可重复利用次数多。本专利技术中，比活力指每克蛋白质所具有酶的活力单位(U)数；1个活力单位是指在特定条件(温度为25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。酶活回收率＝固定化酶的酶活力/生产固定化酶所用的粗酶粉的酶活力。另一方面，本专利技术提供所述固定化转氨酶的制备方法。一种制备前述固定化转氨酶的方法，包括：ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在15℃-35℃搅拌反应6小时-24小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到所述固定化转氨酶。在一些实施方式中，ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在20℃-30℃搅拌反应8小时-16小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到固定化转氨酶粗品；所得粗品在pH为8.0-9.5的甘氨酸钠溶液中，在20℃-30℃搅拌8小时-16小时，然后分离，用水洗涤，得到固定化转氨酶产物。在一些实施方式中，将固定化酶载体进行纯化后再用于制备固定化转氨酶。在一些实施方式中，将固定化酶载体在pH为7.0-9.0的体系中，搅拌下加入5％的戊二醛水溶液，在15℃-35℃搅拌反应0.5小时-5小时后过滤，用水洗涤，得到固定化酶载体，再用于制备固定化转氨酶。在一些实施方式中，所述pH为7.0-9.0的体系为磷酸二氢钠-氢氧化钠水溶液体系。在一些实施方式中，所述pH为7.0-9.0的体系为三乙醇胺-盐酸溶液体系。所述固定化转氨酶的制备过程中，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。另一方面，本专利技术提供一种用所述固定化转氨酶制备氨基化合物的方法。所述固定化转氨酶用于制备氨基化合物过程中，反应条件温和，对环境友好，操作简便，酶活性损失少，酶可多次重复利用，提供的制备方法具有较好的工业应用前景。一种制备化合物II的方法，包括：化合物I在前述固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，与氨基供体接触反应，得到化合物II，其中，R为氨基的保护基。根据本专利技术的实施例，所述氨基保护基可为选自叔丁氧羰基、苄基、苄氧羰基、乙酰基、对甲基苯磺酰基、笏甲氧羰基中的任意一种。在一些实施方式中，所述氨基保护基为叔丁氧羰基。在一些实施方式中，所述氨基保护基为苄基或苄氧羰基。所述反应的反应温度为5℃-60℃。在一些实施方式中，所述反应的反应温度为20℃-60℃，有利于反应进行和控制。所述反应的反应时间为8小时-30小时。在一些实施方式中，所述反应的反应时间为10小时-16小时，有利于反应控制。一些实施方式中，在pH值9.0-10.5或9.0-10.0条件下，有利于化合物I与氨基供体接触反应，有利于制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在35℃-60℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在35℃-55℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在45℃-60℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在45℃-55℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在50℃-60℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值9.0-10.5条件下，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值9.0-10.5条件下，化合物I与氨基供体接触，在35℃-60℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值9.0-10.5条件下，化合物I与氨基供体接触，在20℃-40℃反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-30小时，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在10℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-24小时，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在15℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-20小时，制得化合物II。在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化转氨酶，所述固定化转氨酶是ω‑转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。

【技术特征摘要】
2018.02.08 CN 20181013009231.一种固定化转氨酶，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。2.权利要求1所述的固定化转氨酶，其制备方法包括：ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在15℃-35℃搅拌反应6小时-24小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到固定化转氨酶。3.一种制备权利要求1所述的固定化转氨酶的方法，包括：ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在15℃-35℃搅拌反应6小时-24小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到固定化转氨酶；任选将所得到的固定化转氨酶在pH为8.0-9.5的甘氨酸钠溶液中，在20℃-30℃搅拌8小时-16小时，然后分离，用水洗涤，得到固定化转氨酶产物。4.一种制备化合物II的方法，包括：化合物I在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，与氨基供体接触反应，得到化合物II，其中，R为氨基的保护基；所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂、氨基载体树脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：丰亚辉，陈明洪，王仲清，刘彬，罗忠华，黄芳芳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44