一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种交联固定化脂肪酶‑高分子材料复合物的制备方法及其应用。与传统的酶固定化方法比，该方法首先采用高分子材料对脂肪酶进行修饰作用，然后在室温条件下对修饰后的脂肪酶进行交联固定化制备得固定化脂肪酶‑高分子材料复合物。与现有技术相比，本发明专利技术固定化脂肪酶‑高分子材料复合物具有良好的热稳定性、热稳定性，且经过多次重复使用后仍保留较高的催化活力。另外，制备方法简单，能耗低，降低了生产成本，因此，可批量化生产，将本发明专利技术固定化脂肪酶‑高分子材料复合物用于制备去污剂、分解油脂、制备生物柴油、拆分手性异构体、合成高聚物、去除纸浆中的树脂或皮革脱脂。

Preparation and Application of a Cross-linked Immobilized Lipase-Polymer Material Complex

The invention belongs to the field of biotechnology, and specifically discloses a preparation method and application of cross-linked immobilized lipase polymer material complex. Compared with the traditional immobilization method, the immobilized lipase-polymer composite was prepared by crosslinking and immobilizing the modified lipase at room temperature. Compared with the prior art, the immobilized lipase and polymer material composite of the invention has good thermal stability and thermal stability, and retains high catalytic activity after repeated use. In addition, the preparation method is simple, the energy consumption is low, and the production cost is reduced. Therefore, the immobilized lipase and macromolecule material complex of the invention can be used in batch production to prepare detergent, decompose grease, prepare biodiesel, split chiral isomers, synthesize polymers, remove resin or leather degreasing in pulp.

【技术实现步骤摘要】
一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法及其应用。
技术介绍
相比于化学催化剂，作为生物催化剂的酶蛋白在催化活力、选择性与专一性等方面都有着优越的功能特性，可以在温和的反应环境中催化许多复杂的化学过程，因此在许多工业领域中有着广泛的应用，例如：医药中间体合成、分析检测、食品加工过程以及精细化工品制备等。其中，脂肪酶具有较为广泛的底物谱，除了可以催化水解甘油三酯，还可以催化酯化、酯交换、手性拆分等反应，因此被普遍用于去污剂制备、油脂分解、生物柴油制备等领域。但是，在实际工业使用过程中，使用游离的脂肪酶通常会出现催化不稳定、容易失活、与产物较难分离以及不能重复使用等缺点，严重限制了脂肪酶的进一步应用。通过筛选合适的固定化载体与方法，将脂肪酶进行固定化，可以有效解决上述问题。酶固定化的方法通常分为四种：物理吸附、共价键合、包埋以及交联。使用载体固定化酶时，酶的负载量较低，通常会降低酶催化剂的生产能力。除此之外，为了为各类的催化环境挑选合适的酶固定化载体，会进行大量的筛选优化载体的实验，不仅耗费大量的时间与精力，还会造成固定化成本的增加。交联酶聚集体是一种非载体固定化酶技术，由于其单位体积的催化活性较高且不需要使用昂贵的固定化载体，因此在固定化脂肪酶领域受到了广泛关注。专利CN103320420A（201310253376.9）公开了一种磁性交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用。该方法将表面带树枝状多胺基的功能基化磁性纳米颗粒与脂肪酶分散在缓冲液中，在低温条件下加入沉淀剂使其沉淀，再使用交联剂对其交联，反应后通过固液分离、洗涤以及冷冻干燥得到磁性交联脂肪酶聚集体。专利CN107012136A（201710438404.2）公开了一种固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法。该方法在低温环境中，将酶液加入有机溶剂中静置沉淀，取沉淀加入交联剂与大孔吸附树脂振荡进行交联固定化，反应完全后将反应液真空干燥制备固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。上述专利都利用戊二醛交联酶蛋白制备固定化脂肪酶，都是先在低温条件下对脂肪酶进行沉淀后，并且使用了磁性纳米颗粒与大孔吸附树脂，造成了脂肪酶固定化成本的增加。而且，酶的催化活力与稳定性在固定化过程中也受到了一定程度的影响，难以在各类催化环境中都保持较高的催化活力，且难以重复使用多次后仍能保持较高的酶活。申请号201110106886.4公开了一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法。该方法的核心是采用疏水性试剂甲基丙烯酸缩水甘油酯对脂肪酶表面进行化学修饰，引入碳碳双键基团，然后无需中间产物分离步骤，直接加入含有碳碳双键的乙烯基单体为原料，引发自由基聚合得到目标产物。该方法生产条件温和，制备过程简单，可以有效避免中间修饰步骤的酶活损失，实现高酶活收率，同时显著提高脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的热稳定性，并且新方法简化了中间产物分离步骤，降低生产成本，便于实现大规模工业制备。但是，通过此方法制备的固定化脂肪酶难以在各类反应介质中均保持良好的分散性能，在催化过程中容易出现团聚的现象，使得固定化脂肪酶的催化效率有所降低。
技术实现思路
为了解决脂肪酶固定化现有技术所存在的问题，本专利技术提供了一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法及其应用。该方法采用高分子材料修饰脂肪酶，并用戊二醛对其与牛血清白蛋白进行交联，制备得固定化脂肪酶-高分子材料复合物。在保持脂肪酶催化活力的基础上，有效降低了脂肪酶的固定化成本，并且使其在稳定性与重复利用率方面都具有优异的性能，进一步拓宽了固定化脂肪酶的应用领域。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法，包括以下步骤：步骤1，高分子材料醛基化向有机试剂A中加入高分子材料，待溶解完全后加入氧化剂，醛基化反应4-48h后，浓缩反应液至原体积的10%，再向浓缩后的反应液中加入有机试剂B，过滤并洗涤烘干沉淀物，即得醛基化高分子材料；步骤2，醛基化高分子材料修饰脂肪酶向缓冲液中加入脂肪酶和醛基化高分子材料，室温下搅拌反应0.5-8h，再加入还原剂，继续反应10-40h，得含有脂肪酶-高分子材料复合物的溶液；步骤3，交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物向含有脂肪酶-高分子材料复合物的溶液中加入有机试剂C，室温搅拌后，加入牛血清白蛋白，继续搅拌5-240min后，再加入戊二醛溶液进行交联，持续搅拌30min-48h，加入赖氨酸溶液，继续搅拌30min-48h，离心后，用蒸馏水清洗沉淀物，干燥即得固定化脂肪酶-高分子材料复合物。进一步改进的是，步骤1中有机试剂A为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中一种或多种混合而成；有机试剂B为石油醚、乙醚或正己烷中一种或多种混合而成；高分子材料为Pluronic®F-127、Pluronic®F-68、Pluronic®P-123、Pluronic®L-81、Pluronic®L-31或含有羟基的高分子化合物中的一种或多种混合而成；氧化剂为戴斯-马丁氧化剂、二氧化锰、氯铬酸吡啶、重铬酸吡啶鎓或三氧化铬中一种或多种混合而成。进一步改进的是，步骤2中脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、米曲霉脂肪酶、假单胞菌属脂肪酶、嗜热栖热菌脂肪酶、米根霉脂肪酶或黑曲霉脂肪酶；缓冲液为磷酸缓冲液，浓度为10-200mmol/L；pH值为6-9；还原剂为硼氢化钠或氰基硼氢化钠。进一步改进的是，步骤3中有机溶剂C为异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈中一种或多种混合而成；戊二醛的体积分数为50%，添加量为20μL-200mL；赖氨酸的摩尔浓度为1mol/L，添加量为20μL-200mL；离心的转速为4000-15000rpm，离心时间为3-60min；干燥为冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥或自然风干。上述固定化脂肪酶-高分子材料复合物在制备去污剂、分解油脂、制备生物柴油、拆分手性异构体、合成高聚物、去除纸浆中的树脂或皮革脱脂中的应用。有益效果与现有技术相比，本专利技术的优势在于：1、本专利技术所述的交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的方法在室温条件下进行，减少了脂肪酶固定化的能耗。且没有引入其它固定化载体，使得固定化后的脂肪酶更容易与底物相结合，降低了固定化的成本。2、本专利技术所述的交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的方法使用高分子材料修饰脂肪酶，没有造成脂肪酶的催化活力的下降，增强了脂肪酶在水相与有机相中的分散性能。3、本专利技术所述的固定化脂肪酶-高分子材料复合物具有良好的热稳定性及重复使用性。4、本专利技术所述的固定化脂肪酶-高分子材料复合物可以批量快速便捷制备，在去污剂制备、油脂分解、生物柴油制备等领域有着广泛的应用前景。附图说明图1为实施例1所制备的脂肪酶-醛基化Pluronic®F-127复合物与游离脂肪酶的热稳定性图；图2为实施例1所制备的脂肪酶-醛基化Pluronic®F-127复合物的重复利用率图。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术的专利技术方法进行详细描述和说明。其内容是对本专利技术的解释而非限定本专利技术的保护范围。实施例1脂肪酶-醛基化Pluronic本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种交联固定化脂肪酶‑高分子材料复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，高分子材料醛基化向有机试剂A中加入高分子材料，待溶解完全后加入氧化剂，醛基化反应4‑48h后，浓缩反应液至原体积的10%，再向浓缩后的反应液中加入有机试剂B，过滤并洗涤烘干沉淀物，即得醛基化高分子材料；步骤2，步骤2，醛基化高分子材料修饰脂肪酶向缓冲液中加入脂肪酶和醛基化高分子材料，室温下搅拌反应0.5‑8h，再加入还原剂，继续反应10‑40h，得含有脂肪酶‑高分子材料复合物的溶液；步骤3，交联固定化脂肪酶‑高分子材料复合物向含有脂肪酶‑高分子材料复合物的溶液中加入有机试剂C，室温搅拌后，加入牛血清白蛋白，继续搅拌5 ‑240min后，再加入戊二醛溶液进行交联，持续搅拌30 min‑48 h，加入赖氨酸溶液，继续搅拌30 min‑48 h，离心后，用蒸馏水清洗沉淀物，干燥即得固定化脂肪酶‑高分子材料复合物。

【技术特征摘要】
1.一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，高分子材料醛基化向有机试剂A中加入高分子材料，待溶解完全后加入氧化剂，醛基化反应4-48h后，浓缩反应液至原体积的10%，再向浓缩后的反应液中加入有机试剂B，过滤并洗涤烘干沉淀物，即得醛基化高分子材料；步骤2，步骤2，醛基化高分子材料修饰脂肪酶向缓冲液中加入脂肪酶和醛基化高分子材料，室温下搅拌反应0.5-8h，再加入还原剂，继续反应10-40h，得含有脂肪酶-高分子材料复合物的溶液；步骤3，交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物向含有脂肪酶-高分子材料复合物的溶液中加入有机试剂C，室温搅拌后，加入牛血清白蛋白，继续搅拌5-240min后，再加入戊二醛溶液进行交联，持续搅拌30min-48h，加入赖氨酸溶液，继续搅拌30min-48h，离心后，用蒸馏水清洗沉淀物，干燥即得固定化脂肪酶-高分子材料复合物。2.根据权利要求1所述的一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法，其特征在于，步骤1中有机试剂A为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中一种或多种混合而成；有机试剂B为石油醚、乙醚或正己烷中一种或多种混合而成；高分子材料为Pluronic®F-127、Pluronic®F-68、Pluronic®...

【专利技术属性】
技术研发人员：戈钧，曹逊，
申请(专利权)人：南京启佑生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32