一个紫花苜蓿MsGPF基因制造技术

本申请属于苜蓿基因组技术领域，具体涉及一个紫花苜蓿生长相关MsGPF基因专利申请事宜。该基因的DNA序列长度为1782bp，其中包含8个外显子和7个内含子。该基因与植物生长发育相关。本申请中，发明专利技术人在筛选鉴定叶片中调控紫花苜蓿秋眠性关键基因过程中，通过转录组测序获得了大量的未知核酸序列，对这些未知序列分析和研究过程中，发明专利技术人发现本申请欲请求保护的MsGPF基因在秋眠型苜蓿秋眠时期叶片中含量显著低于未秋眠时的含量和秋季时非秋眠型苜蓿叶片中的含量，进一步通过转基因技术证明该MsGPF基因的高表达可促进苜蓿的生长。基于此特性，可为高产苜蓿品种培育和苜蓿品种改良奠定良好技术基础。

A MsGPF Gene in Alfalfa

【技术实现步骤摘要】
一个紫花苜蓿MsGPF基因
本申请属于苜蓿基因组
，具体涉及一个紫花苜蓿生长相关MsGPF基因专利申请事宜。
技术介绍
紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是一种世界上广泛种植的多年生豆科牧草。生产应用中，为适应饲喂需要，在其栽培和品种选育中考虑的首要指标是秋眠性。紫花苜蓿的秋眠性是指夏末秋季由于日照时间缩短和温度下降，其植株表现为缓慢匍匐生长或停止生长的一种特性。根据苜蓿秋眠特定时期刈割后植株的再生高度，将其分为三种类型：秋眠型苜蓿（秋眠1-3级）、半秋眠型苜蓿（秋眠4-6级）和非秋眠型苜蓿（秋眠7-9级）。后来又扩展到11个秋眠级别（10-11级），其中包括2个极不秋眠品种。基因工程是研究植物生长发育的重要技术手段之一，也是未来品种改良和品种培育的重要技术手段之一。对于紫花苜蓿的相关基因研究工作目前尚较为有限，急需就特定功能性基因进行深入挖掘和开发，以为将来新品种培育奠定基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一个紫花苜蓿生长相关的MsGPF基因，从而为苜蓿基因组、特定功能性基因开发以及苜蓿新品种培育奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一个紫花苜蓿MsGPF基因，该基因的DNA序列长度为1782bp，具体如SEQIDNO.1所示，其中包含8个外显子和7个内含子；该基因的cDNA序列长度为991bp，具体如SEQIDNO.2所示；其中CDS区长度为663bp，共编码220个氨基酸，所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述紫花苜蓿MsGPF基因的制备获得方法，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：（1）提取基因组以紫花苜蓿WL903品种叶片为样品，提取其基因组DNA；（2）设计扩增用引物；设计扩增用引物序列如下：MsGPFDNA-s:5’-ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTC-3’，MsGPFDNA-a:5’-CGACACAAAAGCCATTTCATAG-3’；（3）PCR进行扩增以步骤（1）中所制备的DNA为模板，利用步骤（2）中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为MsGPF基因。需要介绍的时，前期研究过程中，针对MsGPF基因的cDNA获得，是通过对苜蓿叶片RNA-seq结果中未注释核酸序列采用RACE法扩增获得的，即，根据苜蓿WL903的叶片样品中未注释RNA-seq核酸序列，设计了特异性引物序列如下：GSP1:5’-GATTACGCCAAGCTTATTTTCACTCTGGGCATTGGCTGATGC-3’，GSP2:5’-GATTACGCCAAGCTTTGCCTCCACCCATGCGGAACGAACGAG-3’；然后参考说明书，利用theSMARTer®RACE5’/3’试剂盒Cat.Nos.634858(ClontechLaboratories,Inc.)，同时基于5’RACE和3’RACE各自的反转录特性进行特异性的PCR扩增获得了cDNA序列；所述RNA-seq结果中未注释核酸序列，具体如下：ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTCAACAACTCAGAAAAGAAAACCTAGGGTTCCGCGGAATCGAAAGAGAAGAAAAGAGAGGATTTTAGGGTTTTCAATTCAACAACTCGTTCGTTCCGCATGGGTGGAGGCAGCAAAAGCCGAACAAAAAAGAAATCCAAGTCTATGAAGAAGAAACTGACATCTTCTGAACGTCAATCTATTTATGATCAGATTTATGGTCAGGTACTATCTGATATACAAGCCAAAAAAGTAGCAGAAGAAGAGGAAGCCCGTCGATTAGCAGAAGAGGCTCTTGCTAAAAAAAAAGCAGAAGAAGAAGAAGCCCGTCGATTAGCAAAAGAGGCTCTTGCTCAAAAAAAACTGCAGGCCCGCAAAGCAAAAGAGGCAGCAGAAAAGACTCGTACTCTATTTTCACTCTGGGCATTGGCTGATGCAATGCGCCGTTCTTACTACCCAGACATGACTAGAGAAACGCTTTTTCGAAAACTTGCAAAATCTACAAACACAGCCCTGGACCATG。所述紫花苜蓿MsGPF基因在植物生长培育中的作用，MsGPF与植物生长发育相关；具体与植物株高、植株直径、叶面积等生长特性相关；进一步而言，通过转基因技术将MsGPF超表达后，可促进植物（例如苜蓿，进一步例如转入苜蓿驯鹿品种）的生长。一种提高苜蓿生长特性的转基因品种培育方法，利用基因工程技术手段，借助于表达载体将MsGPF基因在目标植物内进行表达，从而提高其生长量；所述表达载体，具体例如为：pCAMBIA3301；所述目标植物，具体例如为苜蓿驯鹿品种。本申请中，专利技术人在筛选鉴定叶片中调控紫花苜蓿秋眠性关键基因过程中，通过转录组测序获得了大量的未知核酸序列，对这些未知序列分析和研究过程中，专利技术人发现本申请欲请求保护的MsGPF基因在秋眠型苜蓿秋眠时期叶片中含量显著低于未秋眠时的含量和秋季时非秋眠型苜蓿叶片中的含量，进一步通过转基因技术证明该MsGPF基因的高表达可促进苜蓿的生长。基于此特性，可为高产苜蓿品种培育和苜蓿品种改良奠定良好技术基础。附图说明图1为本申请所提供MsGPF的PCR扩增后电泳图；图2为本申请所提供MsGPF过表达后阳性驯鹿植株生长表现。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。生物材料：秋眠型9级苜蓿WL903品种的叶片样品获得过程为：将种植于大田三块试验地中的秋眠型9级苜蓿WL903品种（生长期间进行良好灌溉但未施肥，人工除杂草）分别在5、9月份刈割后第14天取叶片，并将样品立刻放于液氮罐中，回实验室后-80℃冰箱中储存备用。实施例1专利技术人在筛选鉴定叶片中调控紫花苜蓿秋眠性关键基因中，通过测序工作获得了大量的未知核酸序列，经分析发现部分未知序列中含有大的可编码区和完整编码区，进一步结合部分基因在不同生长阶段表达量差异情况，依据表达量差异倍数和可编码序列长度和完整性从众多的未知序列中选定了1个未知基因序列，并将其命名为MsGPF基因。初步基因表达分析表明，MsGPF基因在秋眠型苜蓿秋眠时期叶片中含量显著低于未秋眠时的含量和秋季时非秋眠型苜蓿叶片中的含量，因此初步分析认为MsGPF可能与苜蓿生长高度性状相关。为进一步确定MsGPF基因的表达特性及其结构功能，专利技术人进一步利用PCR扩增技术以及RACE法克隆获得了MsGPF基因序列并对其进行了初步分析，相关实验过程简要介绍如下。（一）基因组DNA以及总RNA的提取利用植物基因组DNA提取试剂盒9768(TakaraBio,Inc.)，参考其说明书，提取获得苜蓿样品叶片基因组DNA，具体操作可参考如下：（1）首先在离心管中加入100mg液氮冷冻粉碎后的植物样品，500ul的BufferHSI和10μL的50×DTTBuffer；混合均匀后，加入10μL的RNaseA(10mg/ml)，充分振荡混匀，于56℃水浴温育10分钟；（2）加入62.5μL的BufferKA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个紫花苜蓿

【技术特征摘要】
1.一个紫花苜蓿MsGPF基因，其特征在于，该基因的DNA序列长度为1782bp，其中包含8个外显子和7个内含子，具体如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述紫花苜蓿MsGPF基因的cDNA，其特征在于，cDNA序列长度为991bp，具体如SEQIDNO.2所示。3.权利要求2所述紫花苜蓿MsGPF基因cDNA所编码氨基酸，其特征在于，共编码220个氨基酸，所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.权利要求1所述紫花苜蓿MsGPF基因的制备获得方法，其特征在于，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：（1）提取基因组DNA提取紫花苜蓿WL903品种基因组DNA；（2）设计扩增MsGPF基因用引物如下MsGPFDNA-s:5’-ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTC-3’，MsGPFDNA-a:5’-CGACACAAAAGCCATTTCAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜红旗，冯长松，徐照学，房卫平，娄治国，袁华祎，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41