39E DNA酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及39E DNA酶及其应用，该39E DNA酶具有：左区、核心区以及右区，所述左区的3’端与所述核心区的5’端相连，所述核心区的3’端与所述右区的5’端相连，所述核心区的A20与C21之间连接有连接体，所述连接体通过羟基与A20的磷酸基团相连，所述连接体通过磷酸基团与C21的5’端羟基相连。发明专利技术人发现，在A20与C21位点之间插入合适种类与合适长度的连接体时，可显著增加链的柔性，在具有铀酰离子的前提下，显著提高了39E DNA酶链对39S底物链的切割速率，显著降低了对铀酰离子的检出限，同时仍对铀酰离子保持很高的离子选择性。

【技术实现步骤摘要】
39EDNA酶及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及39EDNA酶及其应用，更具体地，本专利技术涉及39EDNA酶、增强39EDNA酶活性的方法、复合探针、检测待测样品中铀酰离子含量的方法、试剂盒以及复合探针在制备试剂盒中的用途。
技术介绍
铀是一种放射性元素，主要来源于核泄漏或者核废料的不当处理，其若在人类活动区域内残留超过安全值，将对人类健康造成极大威胁。铀酰离子(UO22+)是铀离子存在形式的其中一种，由于其水溶性好，能够在土壤、河流、湖泊中稳定存在，更容易被人类接触，因此对铀酰离子的检测具有更重要的实际意义。目前对铀酰离子检测主要通过仪器分析和化学分析两种手段：仪器分析如电感偶合等离子体发射光谱(ICP)、原子吸收光谱(AAS)等，这些仪器尽管检出限可测至ng/mL甚至pg/mL，但一般成本高、操作繁琐、不便于现场检测；化学分析方法中，用络合剂配位测试金属离子的方法不够灵敏，检出限较高。通过大量的体外筛选，科研人员发现，39EDNA酶对铀酰离子能够达到nM甚至pM的检出限，并且具有很好的特异性，因此近年来被广泛应用于各个体系中铀酰离子的特异性检测。然而，基于39EDNA酶对铀酰离子检测的灵敏度仍需进一步提高。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：专利技术人在对39EDNA酶序列进行修饰后，意外地发现，在A20与C21之间连接有连接体时，可在保持对酰离子很高的离子选择性的前提下，显著提高39EDNA酶对铀酰离子的检测灵敏性，对铀酰离子的检出限显著降低。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种39EDNA酶，根据本专利技术的实施例，所述39EDNA酶具有：左区、核心区以及右区，所述左区的3’端与所述核心区的5’端相连，所述核心区的3’端与所述右区的5’端相连，所述核心区的A20与C21之间连接有连接体，所述连接体通过羟基与A20的磷酸基团相连，所述连接体通过磷酸基团与C21的5’端羟基相连。需要说明的是，每个所述连接体的两端像天然核苷酸(即由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质形成的DNA或RNA的基本组成单位)一样，都带有磷酸基团和羟基，可以以非天然核苷酸或其类似物的形式通过DNA固相合成仪插入至A20和C21位点之间，连接形式与天然核苷酸之间的连接形式一致。专利技术人发现，在39EDNA酶序列的其他位点插入连接体时，39EDNA酶活性增强的幅度较小甚至减弱，而在A20与C21位点之间插入合适种类与合适长度的连接体时，可增加DNA链的柔性(DNA折叠的空间自由度)，在具有铀酰离子的前提下，39EDNA酶对底物链39S的切割速率显著提高，进而显著降低了对铀酰离子的检出限。根据本专利技术的实施例，上述39EDNA酶还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述连接体的长度不超过预定长度，所述预定长度相当于以碳碳单键相连的12个碳原子形成的碳链长度。需要说明的是，所述预定长度是指不超过相当于12个碳原子之间碳碳单键相连的长度(包括磷酸基团和羟基的长度)。例如，所述连接体为时，所述连接体的长度为11个单键的长度，符合本申请连接体的长度限定要求；所述连接体为时，所述连接体的长度为5个单键的长度，也符合本申请连接体的长度限定要求；而所述连接体为时，所述连接体的长度为14个单键的长度，不符合本申请连接体的长度限定要求。专利技术人发现，若没有连接连接体，链的柔性不高，39EDNA酶的活性弱；若连接体的长度过长(如插入Spacer12即39E-C12)，39EDNA酶的活性不再增强，甚至减弱。专利技术人发现，只有合适长度的连接体如C3Spacer、Spacer6、Spacer9(即形成39E-C3、39E-C6、39E-C9)在关键位点的插入才能够显著增强39EDNA酶的活性。根据本专利技术的实施例，所述连接体包括选自C3Spacer、Spacer6、Spacer9、dSpacer(缺碱基位点，指天然核苷酸缺少碱基后产生的结构)、二巯基化物、脱硫生物素、辛二炔基、氨基修饰物、开环核苷酸的至少之一。在一些实施例中，所述连接体为C3Spacer、Spacer6、Spacer9或dSpacer。专利技术人发现，所述连接体在关键位点的插入能够显著增强39EDNA酶的活性，最高可达3.4倍(39E-C3)。根据本专利技术的实施例，所述脱硫生物素为所述辛二炔基为所述氨基修饰物为根据本专利技术的实施例，所述C3Spacer为所述Spacer6为所述Spacer9为所述dSpacer为根据本专利技术的实施例，所述连接体进一步具有胸腺嘧啶修饰。在一些实施例中，所述胸腺嘧啶修饰包括选自胸腺嘧啶、叠氮修饰的胸腺嘧啶、生物素修饰的胸腺嘧啶、氨基修饰的胸腺嘧啶、超T结构修饰的胸腺嘧啶、荧光团修饰的胸腺嘧啶的至少之一的插入。根据本专利技术的实施例，所述连接体进一步具有脱氧胸腺嘧啶修饰。在一些实施例中，所述脱氧胸腺嘧啶修饰包括选自脱氧胸腺嘧啶、叠氮修饰的脱氧胸腺嘧啶、生物素修饰的脱氧胸腺嘧啶、氨基修饰的脱氧胸腺嘧啶、超T结构修饰的脱氧胸腺嘧啶、荧光团修饰的脱氧胸腺嘧啶的至少之一的插入。专利技术人发现，插入的连接体在具有相同长度的前提下，中间取代物不同(即连接体的修饰基团不同)也会影响39EDNA酶的活性。专利技术人在A20和C21之间分别插入A、T、C、G四种天然核苷酸(即A、T、C、G四种碱基与脱氧核糖以及磷酸基团组成的天然核苷酸)作为连接体，形成39E-A，39E-T，39E-C，39E-G，惊喜地发现39E-T相比于39E活性增强，而39E-A，39E-G，39E-C相比于39E活性减弱。由此，专利技术人发现，所述连接体进一步具有(脱氧)胸腺嘧啶或其衍生物修饰时，39EDNA酶的活性显著增强。根据本专利技术的实施例，所述连接体进一步具有尿嘧啶修饰。在一些实施例中，所述尿嘧啶修饰包括选自尿嘧啶、2’-氟修饰的尿嘧啶、5-溴修饰的尿嘧啶的至少之一的插入。根据本专利技术的实施例，所述连接体进一步具有脱氧尿嘧啶修饰。在一些实施例中，所述脱氧尿嘧啶修饰包括选自脱氧尿嘧啶、2’-氟修饰的脱氧尿嘧啶、5-溴修饰的脱氧尿嘧啶的至少之一的插入。专利技术人发现，所述连接体进一步具有(脱氧)尿嘧啶或其衍生物修饰时，39EDNA酶的活性显著增强。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种增强39EDNA酶活性的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将连接体插入所述39EDNA酶序列A20与C21位点之间，所述连接体通过羟基与A20的磷酸基团相连，所述连接体通过磷酸基团与C21的5’端羟基相连，以便增强39EDNA酶活性。专利技术人发现，在A20与C21位点之间插入合适种类与合适长度的连接体时，可显著增加链的柔性，在铀酰离子存在的前提下，显著提高了39EDNA酶对底物链39S的切割速率，进而显著降低了对铀酰离子的检出限。根据本专利技术的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述连接体如上面任一项所描述的，例如连接体长度的选择和连接体种类的选择。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种复合探针。根据本专利技术的实施例，所述复合探针包括：核心区，所述核心区由39EDNA酶的核心区构成；双链区，所述双链区由39EDNA酶的左区和右区与底物3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种39E DNA酶，其特征在于，具有：左区、核心区以及右区，所述左区的3’端与所述核心区的5’端相连，所述核心区的3’端与所述右区的5’端相连，所述核心区的A20与C21之间连接有连接体，所述连接体通过羟基与A20的磷酸基团相连，所述连接体通过磷酸基团与C21的5’端羟基相连。

【技术特征摘要】
1.一种39EDNA酶，其特征在于，具有：左区、核心区以及右区，所述左区的3’端与所述核心区的5’端相连，所述核心区的3’端与所述右区的5’端相连，所述核心区的A20与C21之间连接有连接体，所述连接体通过羟基与A20的磷酸基团相连，所述连接体通过磷酸基团与C21的5’端羟基相连。2.根据权利要求1所述的39EDNA酶，其特征在于，所述连接体的长度不超过预定长度，所述预定长度相当于以碳碳单键相连的12个碳原子形成的碳链长度；任选地，所述连接体包括选自C3Spacer、Spacer6、Spacer9、dSpacer、二巯基化物、脱硫生物素、辛二炔基、氨基修饰物、开环核苷酸的至少之一；优选地，所述连接体为C3Spacer、Spacer6、Spacer9或dSpacer；优选地，所述脱硫生物素为所述辛二炔基为所述氨基修饰物为任选地，所述C3Spacer为所述Spacer6为所述Spacer9为所述dSpacer为任选地，所述连接体进一步具有胸腺嘧啶修饰；任选地，所述胸腺嘧啶修饰包括选自胸腺嘧啶、叠氮修饰的胸腺嘧啶、生物素修饰的胸腺嘧啶、氨基修饰的胸腺嘧啶、超T结构修饰的胸腺嘧啶、荧光团修饰的胸腺嘧啶的至少之一的插入；任选地，所述连接体进一步具有脱氧胸腺嘧啶修饰；任选地，所述脱氧胸腺嘧啶修饰包括选自脱氧胸腺嘧啶、叠氮修饰的脱氧胸腺嘧啶、生物素修饰的脱氧胸腺嘧啶、氨基修饰的脱氧胸腺嘧啶、超T结构修饰的脱氧胸腺嘧啶、荧光团修饰的脱氧胸腺嘧啶的至少之一的插入；任选地，所述连接体进一步具有尿嘧啶修饰；任选地，所述尿嘧啶修饰包括选自尿嘧啶、2’-氟修饰的尿嘧啶、5-溴修饰的尿嘧啶的至少之一的插入；任选地，所述连接体进一步具有脱氧尿嘧啶修饰；任选地，所述脱氧尿嘧...

【专利技术属性】
技术研发人员：向宇，冯梦莉，陶晶，童爱军，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11