包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法技术方案

本发明专利技术属于生物信息学和基因工程技术领域，公开了一种包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA‑UTR相互作用的方法，确定5’UTR序列；获取靶UTR序列；获取双荧光报告基因系统骨架；构建含UTR的双荧光报告基因系统；将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；用流式细胞术分析相互作用关系，进行荧光强度定量分析。本发明专利技术操作十分简单；能快速确定sRNA与靶UTR之间是否存在相互作用关系，便于批量操作利用的双荧光报告基因系统可用于定量分析相互作用的强度，也可以移植到除运动发酵单胞菌以外其他物种中使用。

Dual Fluorescent Reporter Gene System Containing UTR and Method for Identification of sRNA-UTR Interaction

The invention belongs to the field of bioinformatics and genetic engineering technology, and discloses a dual fluorescent reporter gene system containing UTR, a method for identifying the interaction between sRNA and UTR, determining 5'UTR sequence, acquiring target UTR sequence, acquiring the framework of dual fluorescent reporter gene system, constructing a dual fluorescent reporter gene system containing UTR, and transferring plasmids to wild-type Zymomonas mobilis and corresponding sRNA. In knockout or overexpression strains, the final strain was determined by PCR and sequencing, and the interaction was analyzed by flow cytometry, and the fluorescence intensity was quantitatively analyzed. The invention has simple operation, can quickly determine whether there is an interaction relationship between sRNA and target UTR, and can be used for quantitative analysis of interaction intensity by dual fluorescence reporter gene system, which is convenient for batch operation, and can also be transplanted to other species except Zymomonas mobilis.

【技术实现步骤摘要】
包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法
本专利技术属于生物信息学和基因工程
，尤其涉及一种包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：随着高通量测序技术的快速发展，大量的物种基因组得以测序并给予注释，其中非编码序列中的小RNA(smallRNAs，sRNAs)作为一个在细胞生长过程中起重要作用的调控因子，也被大量发现、挖掘和鉴定。sRNAs有不同的作用模式，它们大多数是与靶mRNA相互作用以控制mRNA的翻译过程，它们还可以与蛋白质相互作用形成作用复合物或控制蛋白质含量。其中，sRNA与其靶mRNA的相互作用可能发生在5’UTR(5’un-translationalregion)非编码区域，也可能发生在编码区域(codingregion)，因此对其相互作用位置的准确定位及相互作用的强度鉴定非常重要，有利用实现对基因表达的准确调控。现有技术EMSAs(electrophoreticmobilityshiftassays)来检测RNA-RNA的相互作用需要在体外进行，需要对RNA进行体外转录或者带上标签后进行破细胞提取，并且RNA易降解，对环境及操作要求高，在体外进行相关凝胶实验、制备探针操作繁琐，也不便于批量操作，同时聚丙烯凝胶具有一定毒性。以上这些不足给相关研究的研究造成了困难，使得相关研究进展缓慢。综上所述，现有技术存在的问题是：传统的EMSA方法，操作十分繁琐。而且在体内进行检测时，不能免去体外获取实验材料及体外进行相关实验的麻烦，造成不能快速确定sRNA与靶UTR之间是否存在相互作用关系，不便于批量操作，并且不能用于定量分析目的sRNA与其靶5’UTR之间的相互作用的强度。解决上述技术问题的难度：需要一种方便的实验材料获取方法。需要一种可批量的、方便的操作方法。需要提高实验的安全性。解决上述技术问题的意义：解决上述技术问题可以提供一种方便、快速、安全、可批量化的研究RNA-RNA相互作用的方法，有利于加快相关领域的研究进展。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法。本专利技术是这样实现的，一种基于所述包含UTR的双荧光报告基因系统的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法包括：第一步，利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点；第二步，以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；第三步，以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；第四步，利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统；第五步，得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；第六步，用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。进一步，所述第一步中利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点后，保留从转录起始位点开始至起始密码子ATG后99-bp作为靶5’UTR序列。进一步，所述第二步中引物序列为：SEQIDNO：2和SEQIDNO：3。进一步，所述第三步中以含有Pgap启动子的双荧光报告基因系统为模板，用引物Prtt-F、PgapTSS-R进行PCR扩增得到载体骨架序列；引物序列为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5。进一步，所述第五步中用引物Pdual-F,Pdual-R进行PCR阳性克隆验证；引物序列为：SEQIDNO：6和SEQIDNO：7。本专利技术的另一目的在于提供一种包含UTR的双荧光报告基因系统，所述包含UTR的双荧光报告基因系统以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架；利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统。本专利技术的另一目的在于提供一种所述鉴定sRNA-UTR相互作用的方法在物种基因组测序中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术方便快捷，相比于传统的EMSA方法，操作十分简单。本专利技术基于流式细胞术的双荧光报告基因系统，在体内进行检测，免去了体外获取实验材料及体外进行相关实验的麻烦，能快速确定sRNA与靶UTR之间是否存在相互作用关系，便于批量操作。本专利技术的方法利用的双荧光报告基因系统可用于定量分析相互作用的强度，也可以移植到除运动发酵单胞菌以外的其他物种中使用本专利技术提供一种鉴定sRNA与其靶mRNA的5’UTR相互作用的方法，建立可以快速高效的确定目的sRNA与其靶5’UTR之间的相互作用关系，并可以进行定量分析。本专利技术的方法简单易于操作，可容易推广到其它物种。附图说明图1是本专利技术实施例提供的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法原理流程图；图中：TSS表达转录起始位点，ATG表示起始密码子，WT表示野生型菌株，ΔsRNA表示目的sRNA敲除菌株，OE_sRNA表示目的sRNA过表达菌株。图3是本专利技术实施例提供的Zms4与其靶UTR之间的相互作用示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术以运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)为模式菌株，建立了一套基于双荧光报告基因系统的检测及鉴定sRNA与靶mRNA5’UTR区域的作用关系及相互作用的强度。本专利技术的检测基于流式细胞术，比传统的EMSA的方法快速方便，且相较于目前已有的单荧光报告基因系统而言，本专利技术中使用的双荧光报告基因系统可以对作用对之间的相互作用强度进行定量分析。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法包括以下步骤：S101：利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点后，保留从转录起始位点开始至起始密码子(ATG)后99-bp作为靶5’UTR序列。S102：以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。S103：以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。S104：利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统。S105：得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株。S106：用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。下面结合具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步的描述。实施例1：验证Zms4-UTR1754的相互作用(1)取基因ZMO1754基因与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定sRNA‑UTR相互作用的方法，其特征在于，所述鉴定sRNA‑UTR相互作用的方法包括：第一步，利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点；第二步，以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；第三步，以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；第四步，利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统；第五步，得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；第六步，用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述鉴定sRNA-UTR相互作用的方法包括：第一步，利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点；第二步，以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；第三步，以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；第四步，利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统；第五步，得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；第六步，用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。2.如权利要求1所述的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述第一步中利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点后，保留从转录起始位点开始至起始密码子ATG后99-bp作为靶5’UTR序列。3.如权利要求1所述的鉴定sRNA-U...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世辉，杨永富，李闰霞，马立新，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42