一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的化学结构式为：

A ratio-type fluorescent probe for detecting intracellular pH and its preparation and Application

The invention provides a ratio type fluorescent probe for detecting intracellular pH, a preparation method and application thereof. The chemical structure of the fluorescent probe is as follows:

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其应用。
技术介绍
pH值作为细胞内新陈代谢的重要参数之一，在维持细胞生长、增殖、凋亡及信号传导等正常生理过程中起着关键性作用。除此之外，细胞的内吞、吞噬及受体配体的内化作用等内化通路也会受到pH的影响。正常生物体内体液酸碱度(pH值)总是稳定在一定范围之内，人体最佳pH呈弱碱性，为7.35-7.45，当其发生上下波动时可能会导致细胞功能发生障碍，严重的可以危机生命安全。若pH低于正常值，细胞呈酸性会抑制酶及激素活性，降低组织功能，也会使人体免疫力下降，红细胞及血小板易发生聚集。同事，酸性细胞环境不利于钙吸收，造成骨质疏松，而且也有研究表明细胞pH环境处于6.2-6.9范围内会使得其癌变的几率大大增加。若pH值偏高会发生碱中毒，酸碱平衡紊乱也会对人体某些器官造成不可逆损伤。目前，可用于检测细胞内pH值的方法包括31P核磁共振法，微电极法，吸收光谱法等，但这些方法存在机械损伤、价格昂贵，难以精确测量等缺点。而荧光光谱法则是利用荧光参数如荧光强度、荧光寿命等变化对pH值进行测定，灵敏度高，选择性好，响应速度快等优点，更重要的是能够实时原位监测细胞内pH的变化而成为目前广泛采用的检测细胞内pH的一种重要方法。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种检测pH的比率型荧光探针，监测范围广，抗干扰能力强。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内pH的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测pH的比率型荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）将4-氰基苯硼酸，5-溴水杨醛，Pd(dppf)Cl2（[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯），醋酸钾溶于1,4-二氧六环，在氮气保护下加热搅拌至反应充分，将反应液冷却至室温，过滤除去固体杂质，滤液分离纯化得到浅黄色化合物1：；（2）化合物1，邻氨基苯硫酚在对甲基苯磺酸存在下于二甲基甲酰胺中加热搅拌反应；反应完成后，将反应液在0℃左右迅速冷却，后向反应液中加入水，得到黄色固体沉淀，分离沉淀并纯化得到化合物2，即荧光探针：。步骤（1）中，4-氰基苯硼酸与5-溴水杨醛的摩尔比为0.8-1:1-1.5。步骤（2）中，化合物1与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1-1.5。步骤（1）中，分离纯化过程为：以石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液，将滤液通过柱层析（石油醚：乙酸乙酯=5:1）。步骤（2）中，纯化过程为：以石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液，将沉淀通过柱层析得到探针。一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中pH的应用。本专利技术的机理如下：本专利技术所述的荧光探针具有2-（2’-羟基苯基）苯并噻唑（HBT）基团，在pH逐渐向碱性条件变化时，探针上羟基氢与苯并噻唑的氮原子形成分子内氢键形成ESIPT过程，此时蓝色荧光发生增强；而在酸性环境下时，ESIPT过程阻断从而发出绿色荧光；可采用荧光检测器通过检测不同波长的荧光强度，实现pH的检测。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的检测细胞内pH的比率型荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内pH的实时测定。该探针的灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（415-700nm），通过绘制标准曲线进行细胞内pH的测定，可以实现对细胞内pH快速准确检测的目的。本专利技术的探针具有广阔的应用前景。附图说明图1是荧光探针的1HNMR图谱；图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱；图3是荧光探针的荧光强度与pH的线性关系；图4是荧光探针分别在pH6.5和pH7.5时与不同物质反应后的荧光强度；图5是荧光探针对活细胞的毒性实验；图6是荧光探针在活细胞中的荧光成像应用。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成将4-氰基苯硼酸（147mg，1mmol），5-溴水杨醛（201mg，1mmol），Pd(dppf)Cl2（146mg，20mol%），醋酸钾（393mg，4mmol）溶于10mL1,4-二氧六环中加热搅拌至90℃，在氮气保护下充分反应12小时。反应停止后，将反应液冷却至室温，过滤除去固体杂质，然后以石油醚：乙酸乙酯=5:1v/v为淋洗液将滤液通过柱层析提纯的黄色固体粉末为化合物1：；取化合物1（88mg，0.4mmol），邻氨基苯硫酚（50mg，0.4mmol）用5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后加入对甲基苯磺酸（10mg，0.058mmol）在90℃条件下加热搅拌2h。反应完成后，将反应液在0℃左右迅速冷却，后向反应液中加入5mL水，得到黄色固体沉淀，抽滤得粗产品。将粗产品通过柱层析进行提纯分离得到化合物2，即为荧光探针；其1HNMR图谱如图1：。实施例2荧光探针对pH的响应预先准备13份4mL的5μM探针缓冲溶液，含5%甲醇，pH分别为3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9。然后进行荧光扫描（λex=405nm）；计算各体系中荧光强度；该探针对不同pH的响应如图2所示：随着pH由酸性逐渐变为碱性，473nm处的荧光强度（I473）逐渐增强，546nm处的荧光强度（I546）没有明显变化。计算I473/I546的比值，作I473/I546与pH的线性关系如图3所示：在pH6.5-8.5范围内，pH变化与I473/I546线性相关。实施例3荧光探针对不同离子的选择性预先准备20份4mL的5μM探针缓冲溶液(含5%甲醇，pH=6.5和7.5)，然后分别向该体系中依次加入100μL浓度为40mM的不同检测物的PBS溶液。然后进行荧光检测（λex=405nm，λem=473nm和546nm）；计算各体系中I473/I546；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性，结果如图4所示，其中，1-空白，2-AlCl3，3-CaCl2，4-NaClO，5-CuSO4，6-Cys，7-NaF，8-FeSO4，9-Fe2(SO4)3，10-GSH，11-H2O2，12-H2S，13-Hcy，14-MgCl，15-CoCl2，16-SO2，17-ZnCl：在相同条件下加入不同离子，发现该探针受到离子的影响不大。实施例4荧光探针对细胞的毒性准备浓度为5-50μM的探针缓冲溶液(含5%甲醇，pH=7.4)，采用MTT比色法，分析A549细胞在加入荧光探针后的吸光度，计算细胞存活率，结果如图5所示：在浓度为5-50μM时，细胞的存活率为98%-83%，浓度小于10μM时，细胞存活率在95%以上。实施例5荧光探针在活细胞中的成像应用将A549细胞放在培养基（DMEM培养液和10%胎牛血清）中，放置于条件为37℃、5%CO2和20%O2的培养箱中培养24h。用微量进样器吸取实施例1制备的荧光探针（10μM）注入pH分别为5.5，6.5，7.5，8.5的PBS缓冲液处理过的A549细胞中，继续在培养箱中培养10min并进行在蓝通道与绿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测pH的比率型荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种检测pH的比率型荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将4-氰基苯硼酸，5-溴水杨醛，Pd(dppf)Cl2，醋酸钾溶于1,4-二氧六环，在氮气保护下加热搅拌至反应充分，将反应液冷却至室温，过滤除去固体杂质，滤液分离纯化得到浅黄色化合物1：；（2）化合物1和邻氨基苯硫酚在对甲基苯磺酸存在下于二甲基甲酰胺中加热搅拌反应；反应完成后，将反应液在0℃左右迅速冷却，后向反应液中加入水，得到黄色固体沉淀，分离沉淀并纯化得到化合物2，即...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，宋文辉，董宝利，张楠，卢雅茹，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37