检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于合成与检测技术领域，尤其涉及检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其制备方法和应用。本发明专利技术提供检测过氧亚硝酸根的通用型识别基团，并将其与常用荧光团连接构建出了三种新的荧光探针，分别命名为BT‑FAP、NA‑FAP、NR‑FAP，它们分别以苯并噻唑‑氨基萘(BT)、萘酰亚胺(NA)、苯并吩噁嗪(NR)为荧光团，以甲酰胺(FAP)作为识别基团，可实现与ONOO

【技术实现步骤摘要】
检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于合成与检测
，尤其涉及基于甲酰胺识别基团、可用于检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其制备方法与应用。
技术介绍
在生物体内，过氧亚硝酸根(ONOO-)是重要的活性氮物种，由超氧自由基阴离子和一氧化氮反应生成，能同时代表氧化应激和硝化应激的水平。而且，现有研究已表明，ONOO-与多种疾病的发生和发展密切相关，包括神经退行性疾病、糖尿病、癌症等。ONOO-在生理条件下的半衰期短且稳态浓度极低，使得检测活细胞及活体组织中的ONOO-变得十分困难。基于荧光探针的荧光分析法能够在细胞和动物模型中实时可视化分子事件，为上述问题的解决提供了有效的分析方法。然而，目前已报道的检测ONOO-的荧光探针普遍存在以下问题：(1)识别基团不具有普遍适用性，很难推广到其他荧光基团，增加了新探针的设计难度；(2)探针化学结构复杂，合成路线长，合成困难，无法实现规模化生产。这些问题造成了现有的ONOO-的荧光探针的实际应用受到了很大限制，不利于大规模推广应用，因此，有必要开发新的用于检测ONOO-的荧光探针及其制备方法。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术旨在提供检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其制备方法和应用。本专利技术提供检测过氧亚硝酸根的通用型识别基团，并将其与常用荧光团连接构建出了三种新的荧光探针，分别命名为BT-FAP、NA-FAP、NR-FAP，它们分别以苯并噻唑-氨基萘(BT)、萘酰亚胺(NA)、苯并吩噁嗪(NR)为荧光团，以甲酰胺(FAP)作为识别基团，可实现与ONOO-瞬时响应(均<4s)，且灵敏度高、选择性好，非常适用于细胞中ONOO-的荧光成像研究。本专利技术的目的之一是提供三种基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针。本专利技术的目的之二是提供上述基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针的制备方法。本专利技术的目的之三是提供上述基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针在肝癌细胞中的成像方法。本专利技术的目的之四是提供基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其在肝癌细胞中的成像方法的应用。为实现上述专利技术目的，具体的，本专利技术公开了下述技术方案：首先，本专利技术公开第一种基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针，将其命名为BT-FAP，其结构式为：其次，本专利技术公开第二种基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针，将其命名为NA-FAP，其结构式为：再次，本专利技术公开第三种基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针，将其命名为NR-FAP，其结构式为：再其次，本专利技术公开上述三种基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针的制备方法，反应方程式分别为：其中，所述化合物1表示苯并噻唑-氨基萘，化合物2表示萘酰亚胺，化合物3表示苯并吩噁嗪。反应步骤为：将上述反应方程式中的化合物1、2或3分别溶于甲酸中，搅拌均匀后，得混合液，反应设定时间，即得。进一步地，上述反应步骤中，所述化合物1、2或3与甲酸的比例为：0.2-1.5mM：0.5-5mL。进一步地，上述反应步骤中，所述反应温度为60-100℃，反应时间为3-6h；优选地，所述反应的温度为75-85℃，反应的时间为4.5-5h。进一步地，上述反应步骤中，还包括将反应产物溶液进行旋干、提纯的步骤。优选地，采用硅胶柱层析对反应产物进行提纯。更优选地，所述硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，且化合物1、2或3分别与甲酸的三个反应产物提纯所用二氯甲烷和甲醇的体积比分别依次为80-130:1，75-125:1，40-60:1；分别优选为100:1，100:1，50:1。另外，本专利技术还公开上述基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针在活细胞中对ONOO-成像中的应用。具体的，所述应用为荧光探针在肝癌细胞中的成像方法，包括如下步骤：将培养好的肝癌细胞用ONOO-释放剂孵育后再用探针的二甲亚砜溶液孵育，孵育设定时间后，除掉探针的二甲亚砜溶液，并用PBS清洗，然后进行激光共聚焦成像，即得。优选的，上述成像方法中，所述ONOO-释放剂为SIN-1。优选的，上述成像方法中，所述孵育的时间为20-40min。最后，本专利技术公开上述基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针及其在肝癌细胞中的成像方法在生物检测领域中的应用。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果是：(1)本专利技术提出的三种探针分子最大荧光发射波长分别位于500nm、560nm、620nm，具有适中的斯托克斯位移(约50nm)，能够有效降低自吸收，提高成像的准确度。(2)本专利技术提出的三种探针分子能够实现对ONOO-的快速响应(均在4s内反应完毕)，而且对ONOO-具有高灵敏度和选择性，探针在活细胞内染色效果良好，染色时间较短(20min)，染色效率较高，非常适用于细胞中ONOO-的荧光成像研究。(3)本专利技术提出的三种探针分子能够实现对SIN-1孵育的肝癌细胞中ONOO-浓度的升高的指示，从而使得检测活细胞及活体组织中的ONOO-更加容易，很好地实现了荧光分析法在细胞和动物模型中实时可视化分子事件。(4)本专利技术的三种探针分子的合成步骤简单、产率高、易纯化；而且本专利技术的制备方法中直接以甲酸作为反应物，同时以甲酸作为溶剂，不使用其他辅助性溶剂或试剂，成本低，对环境污染小。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。图1为实施例1的三种荧光探针对不同浓度的ONOO-的荧光响应光谱图；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。图2为实施例1的三种荧光探针分别在500nm、560nm和620nm处的荧光强度与不同浓度的ONOO-的线性关系；横坐标为ONOO-浓度(μM)，纵坐标为探针在相应波长(500nm、560nm和620nm)处的荧光发射强度。图3为实施例1的三种荧光探针分别在500nm、560nm和620nm处的荧光强度随时间的实时变化图；横坐标为时间(s)，纵坐标为三种探针在相应波长(500nm、560nm和620nm)处的荧光发射强度。图4为在不同种类物质存在时，实施例1的三种荧光探针分别在500nm、560nm和620nm处的荧光强度情况。横坐标为不同种类物质，纵坐标为探针在相应波长(500nm、560nm和620nm)处的荧光发射强度。图5为实施例1的三种荧光探针在肝癌细胞(HepG2)中的荧光成像图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，目前，现有的检测ONOO-的荧光探针普遍存在以下问题：(1)识别基团不具有普遍适用性，很难推广到其他荧光基团，增加了新探针的设计难度；(2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针，其特征在于：分别为BT‑FAP、NA‑FAP或NR‑FAP，其中：所述BT‑FAP的结构式为：

【技术特征摘要】
1.基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针，其特征在于：分别为BT-FAP、NA-FAP或NR-FAP，其中：所述BT-FAP的结构式为：或者；所述NA-FAP的结构式为：或者；所述NR-FAP的结构式为：2.如权利要求1所述的基于甲酰胺识别基团的检测过氧亚硝酸根的荧光探针的制备方法，其特征在于：反应方程式分别为：其中，化合物1表示苯并噻唑-氨基萘，化合物2表示萘酰亚胺，化合物3表示苯并吩噁嗪；反应步骤为：将上述反应方程式中的化合物1、2或3分别溶于甲酸中，搅拌均匀后，得混合液，反应设定时间，即得。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述化合物1、2或3与甲酸的比例为：0.2-1.5mM：0.5-5mL。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述反应温度为60-100℃，反应时间为3-6h；优选地，所述反应的温度为75-85℃，反应的时间为4.5-5h。5.如权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于：还包括将反应产物溶液进行旋干、提纯的步骤；优选地，采用硅胶柱层析对反应产物进行提纯。6.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，解希雷，刘光照，王栩，焦晓云，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37