一种细胞外泌体提取分离的方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞外泌体提取分离的方法，包括以下操作步骤：将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；将收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；用一次性注射器吸取上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；将细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；使用PBS缓冲液对沉淀进行清洗重悬，将液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；使用PBS缓冲液重悬沉淀，即为所提取分离的外泌体产物。

A Method for Extraction and Separation of Exosomes

The invention discloses a method for extracting and separating extracellular secretions, which comprises the following operating steps: putting target cells into selected medium, harvesting them 72 hours after cell culture, centrifuging to obtain supernatant of cell culture medium; using cryogenic centrifuge to centrifuge the supernatant of harvested cell culture medium at 4 C for 6 000 XG for 30 minutes, after centrifugation, transferring supernatant of centrifugal tube to a new tube for reserve; Sedimentation is discarded; supernatant is absorbed by disposable syringe and dripped slowly to 0.22um cell filter membrane for filtration; cell culture medium is put into ultracentrifuge for 4 C, 100 000 XG ultracentrifugation for 70 min, after centrifugation, the supernatant is removed and the precipitation is retained; PBS buffer is used to clean and re-suspend the precipitation, and the liquid is put into ultracentrifuge for 4 C, 1. After centrifugation, the supernatant was carefully sucked out to retain the sediment. PBS buffer was used to re-suspend the sediment, that is, the extracted and separated exosome products.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外泌体提取分离的方法
本专利技术涉及外泌体提取分离
，具体为一种细胞外泌体提取分离的方法。
技术介绍
目前细胞外泌体提取方法主要有超速离心法，密度梯度离心法，高聚物沉淀法以及免疫磁珠法等。现有的外泌体提取方法在操作性，成本，提取效率和产物纯度上难以做到平衡，通常操作简便，耗时较少的方法所提取的外泌体纯度难以保障。而能够获得高纯度外泌体的提取方法往往耗时长，操作复杂且需要昂贵设备支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞外泌体提取分离的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种细胞外泌体提取分离的方法，包括以下操作步骤：S1：细胞培养基上清:将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；S2：低速离心：将S1)中收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；S3：滤膜过滤：用一次性注射器吸取将S2)中获得的上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；S4：超速离心：将S3)中获得的细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；S5：清洗重悬；使用PBS缓冲液将S4)中获得的沉淀进行清洗重悬；S6：再次超速离心：将S5)中获得的液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；S7：重悬沉淀：使用PBS缓冲液将S6)中获得的沉淀进行重悬，即为所提取分离的外泌体产物。优选的，所述细胞培养基上清体积不少于30ml，细胞培养基上清内不含血清或使用不含外泌体的血清。优选的，S2)中沉淀包括细胞培养基内的死细胞以及大的细胞碎片成分，S4)中沉淀部分含有外泌体。优选的，S4)中进行超速离心前对所使用的超速离心管进行灭菌处理。优选的，S5)和S7)中所用PBS缓冲溶液为无菌中性溶液，且不含有不溶颗粒。优选的，S7)中所用PBS缓冲溶液使用体积为50ul，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术所提出的细胞外泌体提取方法，结合了超速离心已经过滤离心的方法，操作简单，省时省力，且不需要特殊装置。所提取的外泌体含量较多，纯度较高，可以用于一系列生物学实验。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种细胞外泌体提取分离的方法，包括以下操作步骤：S1：细胞培养基上清:将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；S2：低速离心：将S1)中收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；S3：滤膜过滤：用一次性注射器吸取将S2)中获得的上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；S4：超速离心：将S3)中获得的细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；S5：清洗重悬；使用PBS缓冲液将S4)中获得的沉淀进行清洗重悬；S6：再次超速离心：将S5)中获得的液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；S7：重悬沉淀：使用PBS缓冲液将S6)中获得的沉淀进行重悬，即为所提取分离的外泌体产物。进一步的，所述细胞培养基上清体积不少于30ml，细胞培养基上清内不含血清或使用不含外泌体的血清。进一步的，S2)中沉淀包括细胞培养基内的死细胞以及大的细胞碎片成分，S4)中沉淀部分含有外泌体。进一步的，S4)中进行超速离心前对所使用的超速离心管进行灭菌处理。进一步的，S5)和S7)中所用PBS缓冲溶液为无菌中性溶液，且不含有不溶颗粒。进一步的，S7)中所用PBS缓冲溶液使用体积为50ul，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。实施例：使用透射电镜对所提取的外泌体进行形态检测：滴加10微升外泌体悬液至铜网上，室温静置20分钟。然后滴加2％醋酸双氧铀负染2分钟，吸去残留液体。接着再滴加2％醋酸双氧铀负染5分钟，吸去残留液体，晾干后使用透射电镜观察，可以观察到双层膜的囊泡结构。本专利技术所提出的细胞外泌体提取方法，结合了超速离心已经过滤离心的方法，操作简单，省时省力，且不需要特殊装置。所提取的外泌体含量较多，纯度较高，可以用于一系列生物学实验。尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：S1：细胞培养基上清:将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；S2：低速离心：将S1)中收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；S3：滤膜过滤：用一次性注射器吸取将S2)中获得的上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；S4：超速离心：将S3)中获得的细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；S5：清洗重悬；使用PBS缓冲液将S4)中获得的沉淀进行清洗重悬；S6：再次超速离心：将S5)中获得的液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；S7：重悬沉淀：使用PBS缓冲液将S6)中获得的沉淀进行重悬，即为所提取分离的外泌体产物。

【技术特征摘要】
1.一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：S1：细胞培养基上清:将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；S2：低速离心：将S1)中收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；S3：滤膜过滤：用一次性注射器吸取将S2)中获得的上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；S4：超速离心：将S3)中获得的细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；S5：清洗重悬；使用PBS缓冲液将S4)中获得的沉淀进行清洗重悬；S6：再次超速离心：将S5)中获得的液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；S7：重悬沉淀：使...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁润中，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：上海,31