一种三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法技术

本发明专利技术公开了一种三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法。该方法的冻存步骤主要为：选取适合冻存的三维视网膜组织，悬浮于RDM培养液，然后转移至冻存管，按等体积比加入2×冷冻保存液，待三维视网膜组织沉至管底后吸走部分的上清液，密封冻存管，置于‑80℃中过夜降温，再移入液氮中保存；最后将保存的视网膜组织解冻复苏即可置于培养箱进行悬浮培养。本发明专利技术提供的方法可重复性好，成功率高，复苏成活率可高达80～90％，使得三维视网膜组织的发育进程可控、保存运输可靠，并保证复苏的组织结构完整、活性良好。

A cryopreservation and resuscitation method for three-dimensional retinal tissue

The invention discloses a method for cryopreservation and resuscitation of three-dimensional retinal tissue. The cryopreservation steps of this method are as follows: selecting three-dimensional retinal tissue suitable for cryopreservation, suspending in RDM culture medium, then transferring to cryopreservation tube, adding 2 x cryopreservation solution according to the same volume ratio, absorbing supernatant after the three-dimensional retinal tissue sinks to the bottom of the tube, sealing the cryopreservation tube, cooling it overnight at 80 C, and then transferring it to liquid nitrogen for preservation; finally, preserving retinal group. Tissue thawing and resuscitation can be placed in the incubator for suspension culture. The method provided by the invention has good repeatability, high success rate and recovery survival rate as high as 80-90%. The development process of the three-dimensional retinal tissue can be controlled, the preservation and transportation can be reliable, and the tissue structure of the resuscitation can be guaranteed to be complete and the activity is good.

【技术实现步骤摘要】
一种三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法
本专利技术涉及干细胞诱导分化及组织冷冻保存
，具体涉及一种由人多能干细胞诱导分化获得的三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法。
技术介绍
目前，干细胞再生技术的突破为难治性疾病的发病机制、新药开发和细胞治疗等研究带来了前所未有的机遇。其中，体外诱导人多能干细胞(hPSC)向具有三维结构的视网膜组织分化的关键技术先后取得突破，成为干细胞体外再生器官的领跑者，相关的临床实验也正在紧锣密鼓的进行。再生所得的视网膜组织是具有紧密的、三维立体结构的组织器官，并且从发育学上来说是神经系统的一部分。组织器官冷冻保存是目前医学界的众多难题之一，更何况神经细胞对温度的敏感性更高。因此，视网膜组织冷冻保存亦是视觉干细胞再生领域的一大难题。此外，组织保存、运输是制约再生技术走向临床应用的关键环节。实际应用中，无法做到每一家医院都配备GMP实验室，因此制备完成的移植供体组织必须有妥善的保存以及运输方法。视网膜组织的诱导分化需要较长的周期，尤其是光感受器细胞的发育，更需要长达数月的培养。因此，临床应用中，“现用现分化”的方法不切实际。可靠的冷冻保存的技术可以供给GMP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维视网膜组织的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：选取三维视网膜组织，将其悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液，然后将三维视网膜组织悬液转移至冻存管中，缓慢加入冷冻保存液并振荡混匀，冷冻保存；所述的RDM培养液为DMEM混合培养基中添加有B27、NEAA和Antibiotic‑Antimycotic的溶液；所述的冷冻保存液含有DMSO、蔗糖、FBS和Blebbistatin。

【技术特征摘要】
1.一种三维视网膜组织的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：选取三维视网膜组织，将其悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液，然后将三维视网膜组织悬液转移至冻存管中，缓慢加入冷冻保存液并振荡混匀，冷冻保存；所述的RDM培养液为DMEM混合培养基中添加有B27、NEAA和Antibiotic-Antimycotic的溶液；所述的冷冻保存液含有DMSO、蔗糖、FBS和Blebbistatin。2.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述的RDM培养液为DMEM混合培养基中添加有2％v/vB27、1％v/vNEAA和1％v/vAntibiotic-Antimycotic的溶液，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12与DMEM按体积比3:2组成；所述的冷冻保存液含3MDMSO、0.3M蔗糖、20％v/vFBS和20μMBlebbistatin，溶剂为水。3.根据权利要求1或2所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述的三维视网膜组织是结构清晰、卵圆形、边界清楚、透光性好、神经视网膜层厚度较大的三维视网膜组织。4.根据权利要求1或2所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述的加入冷冻保存液，其加入体积量是与悬液相同的体积。5.根据权利要求1或2所述的冷冻保存方法，其特征在于，选取三维视网膜组织，将其悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液，每500微升悬液中含有5～10个三维视网膜组织，然后将悬液转移至冻存管，在冰上平衡处理后，加入与悬液等体积的冷冻保存液并振荡，混匀，待三维视网膜组织沉至管底后吸走部分上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛坚，罗子明，冼碧琨，李凯婧，叶美芳，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东,44