一种微藻中虾青素含量快速测定方法技术

基于虾青素特征光学吸收的一种微藻中虾青素含量快速测定方法，通过将一定量微藻利用二甲基亚砜和丙酮进行分步提取，并在丙酮溶液中，以测定474nm处的吸光度值，计算初始微藻中的虾青素含量。相比较传统的液相色谱法和其它溶剂提取法，本方法操作简单，提取效率稳定，且仅使用常规溶剂和分光光度计，适用于生产和流通环节的所需要的快速测定领域。

A Rapid Method for Astaxanthin Content Determination in Microalgae

Based on the characteristic optical absorption of astaxanthin, a rapid method for the determination of astaxanthin content in microalgae was developed. A certain amount of microalgae was extracted by dimethyl sulfoxide and acetone step by step, and the astaxanthin content in initial microalgae was calculated by measuring the absorbance at 474 nm in acetone solution. Compared with traditional liquid chromatography and other solvent extraction methods, this method is simple in operation, stable in extraction efficiency, and only uses conventional solvents and spectrophotometers. It is suitable for rapid determination in production and circulation links.

【技术实现步骤摘要】
一种微藻中虾青素含量快速测定方法
本专利技术涉及一种微藻中虾青素含量的快速测定方法，具体地说是一种基于分光光度法的微藻虾青素的快速测定方法。
技术介绍
虾青素，英文名Astaxanthin，是类胡萝卜素的一种，在呈红色的甲壳类、鱼类及藻类生物中广泛存在。虾青素是自然界中存在的抗氧化性最强的色素类化合物，最为最强的天然抗氧化剂之一，虾青素可以高效去除氧自由基，因此在提高免疫力，延缓衰老，预防肿瘤、心血管疾病，预防紫外损伤，促进皮肤健康等方面有积极的作用。由于其具有穿透血脑屏障的能力，又可以作成为了少数具有健脑、护眼功能的天然化合物之一。而不同来源的虾青素中，藻类来源的左旋虾青素具有最强的生物学活性，其中雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)在特定条件下，虾青素可达细胞干重的1～4％，成为天然虾青素的最理想的来源。在雨生红球藻培养过程中，虾青素含量的测定是重要的过程参数和产品质控指标。现有虾青素检测方法主要有GBT31520-2015(红球藻中虾青素的测定液相色谱法)、GBT3745-2009(饲料添加剂10％虾青素)、Boussiba和Vonshak的方法，美国Cyanotech公司提取流程和日本富士公司提取流程等【陈晓飞，严小军，红球藻虾青素含量测定方法的探讨，《宁波大学学报(理工版)》，2007年12月，第20卷第四期，441-443】，但都存在需要离心、使用专有细胞破碎试剂和复杂提取试剂和测定耗时长的特点。由于雨生红球藻生产企业大多测试设备和专有技术人员缺乏，因此需要新的方法用于实际生产和质控环节。虾青素是一种天然色素，以游离虾青素和虾青素酯的形式存在，在470～480nm之间具有特征吸收峰。作为生产过程评价方法，虾青素的快速定量无需区分其存在形式，因此，利用吸光度法将大大简化测定流程。微藻通常具有富含多糖的细胞壁，需要复杂的操作才能有效的进行破碎，使其内容物释放出来，这也是常规虾青素测定所采用的方法。这些操作包括研磨、反复冻融、使用超声或者其它特殊破碎设备等。但是作为一种快速定量和易操作的方法，利用化学溶剂热处理增强细胞壁和细胞膜的通透性，也能强化后续的提取效率。DMSO是一种优良的溶剂和细胞膜通透剂，对于不饱和烃类的具有很高的溶解度，常用于细胞裂解等作为辅助溶剂。丙酮是常用色素提取剂，但是直接使用丙酮容易引起细胞膜蛋白变性，降低提取效率。通过测试不同的使用量和比例，申请人发现首先使用DMSO提取，再用丙酮提取能够取得最佳的效果。因此，本专利技术在充分考虑到微藻虾青素存在形式和理化特征以及藻细胞的理化特征的基础上，通过优化溶剂提取和操作流程，建立了以虾青素特征波长吸光度测定为基础的快速方法，将测定时间减少到10-20分钟，并保持较高准确性。其创造性在于，通过合理组合使用二甲基亚砜(DMSO)与丙酮两种不同特性的溶剂，并优化溶剂与生物量的比例，利用吸光光度法结合经验公式，实现微藻中虾青素含量的快速测定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种微藻中虾青素含量快速测定方法，以解决现有微藻中虾青素定量分析过程繁琐、耗时长等问题。本专利技术整体操作流程见附图1，具体操作流程如下：1.将5-10mg微藻生物质按照比例与一定量的DMSO混合均匀，加热提取后，通过静置沉降或离心分离固体与DMSO相，将DMSO相取出转移到棕色瓶中。2.向微藻提取残余物中加入与DMSO同等体积的丙酮，混合均匀后，静置沉降或离心分离固体与丙酮相，将丙酮相取出与上一步操作获得的DMSO相合并，并重复本步操作1-2次。3.向收集萃取液中加入丙酮进行定容，最终萃取液体积为初始DMSO体积的30-50倍，用于吸光度的测定。4.在474nm处测定吸光度值，并根据初始生物量计算出虾青素的百分含量。5.为了保证提取效率，DMSO体积与微藻生物质的比例为1mL：5～10mg，DMSO提取温度为40～70℃，加热处理时间为3～15分钟，其中60℃下5分钟为最优条件。为了避免少量微藻参照在提取液中的影响，定容后的提取溶液可经过0.22微米滤膜过滤后在474nm波长下，以丙酮为参比，测定吸光度。6.虾青素在微藻生物质中质量百分含量的计算：藻中虾青素百分含量p(％)＝AV/10bεm，其中A为测定的OD值，V(mL)为最终定容体积，b(cm)为比色池的光路长度，ε(μg-1cm2)为虾青素的吸光系数，取474nm处ε＝0.191μg-1cm2，m(mg)为微藻生物质质量。当使用标准1cm比色杯，该公式可以简化为p(％)＝0.52AV/m。创新性：针对培养微藻生产虾青素过程中需要简捷、快速测定虾青素含量的需求，充分考虑到微藻生物质特点和各种溶剂对生物质的影响，去除了常规破壁、反复离心萃取甚至化学转化的复杂操作，本专利技术所设计方法具有操作简单、设备需求低、快速且结果稳定的特点，能够满足快速取样测定的需要。比较传统的液相色谱法和其它溶剂提取法，本方法操作简单，提取效率稳定，且仅使用常规溶剂和分光光度计，适用于生产和流通环节的所需要的快速测定领域。附图说明：图1操作流程图。具体实施方式实施例1：虾青素在丙酮溶液中吸光系数的测定将虾青素标准品使用丙酮配制成0-10μg/mL的梯度，使用JASCOV-650分光光度计在474nm处以丙酮为参比进行吸光度的测定(结果见附表1)，计算获得474nm处吸光系数为ε＝0.191μg-1cm2。实验操作中，最终的虾青素溶于含有2～3％DMSO的丙酮中，以丙酮为参比，测定DMSO在474nm对吸光度影响，其中2％和3％DMSO对应的吸光度值为0.0006和0.0014，小于标准品梯度最小值0.66μg/mL对应吸光度值的1％，表明以丙酮直接作为参比在本方法精度范围内影响测定结果。当使用标准1cm比色杯，该公式可以简化为p(％)＝0.52AV/m。实施例2：不同DMSO处理温度和时间对提取效率的影响按照附图1中操作流程，称取5mg左右藻粉，加入1mLDMSO,不同温度下的水浴。离心1min，将上清转移到一个50mL棕色容量瓶中；加入1mL丙酮到离心管中，剧烈混合，离心1min，上清转移至容量瓶中，重复提取1～2次，合并上清液，并加入丙酮定容至50mL。按照实施例1所述方法测定474nm吸光值，并计算提取虾青素含量。测定结果见附表2。测定结果表明，伴随温度上升，测定虾青素百分含量由40℃加热15分钟时的5.92％上升至70℃加热5分钟时的6.18％，在上述不同条件下测定结果相对差值在5％以内。考虑到时效因素，选择60℃加热5分钟为优选条件。实施例3：不同虾青素含量藻粉测定结果对比微藻生产虾青素伴随着微藻所处生长状态的不同而具有不同含量，为了检验本方法对培养过程中各个阶段微藻样品测定的有效性，对常见不同虾青素含量样品进行测定，采用实施例2中所选择的60℃加热5分钟条件。测试使用的藻粉虾青素含量在0.5～5％，通过本方法测定计算虾青素含量如附表3。相比预先标定值，提取率均超过95％。附表1虾青素标准品丙酮溶液0～10μg/mL梯度对应474nm处的吸光度值；附表2不同温度与加热时间处理对虾青素含量测定的影响；附表3不同虾青素含量藻粉样品实测与标定值的对比。附表1附表2附表3实施例4：离心与静置处理对测定结果的影响按照附图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微藻中虾青素含量快速测定方法，其特征在于：将微藻生物质依次使用二甲基亚砜(DMSO)和丙酮萃取，分别固液分离，合并萃取液，再向合并的萃取液中加入丙酮定容到确定体积，测定所获得溶液在474nm处的吸光度值，计算微藻中虾青素的百分含量。

【技术特征摘要】
1.一种微藻中虾青素含量快速测定方法，其特征在于：将微藻生物质依次使用二甲基亚砜(DMSO)和丙酮萃取，分别固液分离，合并萃取液，再向合并的萃取液中加入丙酮定容到确定体积，测定所获得溶液在474nm处的吸光度值，计算微藻中虾青素的百分含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体为：a)将微藻生物质与一定量的DMSO混合均匀，加热提取后，通过静置沉降或离心分离固体与DMSO相，将DMSO相取出转移到棕色瓶中；b)向微藻提取残余物中加入与DMSO同等体积的丙酮，混合均匀后，静置沉降或离心分离固体与丙酮相，将丙酮相取出与上一步操作获得的DMSO相合并，并重复本步操作1-2次，合并萃取液；c)向收集萃取液中加入丙酮进行定容，最终定容后萃取液体积为初始DMSO体积的30-50倍，用于吸光度的测定；d)在474nm处测定吸光度值，并根据初始生物量计算出虾青...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛松，曹旭鹏，王书妍，孟迎迎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21