液态25-羟基维生素D校准品稀释液制造技术

本发明专利技术公开了一种液态25‑羟基维生素D校准品稀释液包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。本发明专利技术的主要创新之处在于：a)首次将7‑脱氢胆固醇应用于25‑羟基维生素D校准品稀释液，用于提升25‑羟基维生素D在液态有氧条件下的稳定性；b)校准品稀释液中的所有组分均是最优配方，给25‑羟基维生素D校准品的稳定性提供了有力保障，在2‑8℃条件下可稳定保存12个月；c)将液态25‑羟基维生素D校准品用于血清样品中25羟基维生素D的检测，检测时无需进行校准品复溶，且多次定标的校准曲线可重复性优于冻干校准品的校准曲线。

【技术实现步骤摘要】
液态25-羟基维生素D校准品稀释液
本专利技术涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种稳定的液态25-羟基维生素D校准品稀释液。
技术介绍
维生素D是一种类固醇激素，有两个主要类型：维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化甾醇），它们的结构很相似，只是侧链有差别。人体内的维生素D主要来源于皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射转变成维生素D3，此外还包括从鱼、肉等食物中摄取的维生素D3和膳食补充剂中的维生素D2。无论哪种形式的维生素D，在血液中均与结合蛋白结合后运输至肝脏，在肝脏中被转换成为25-羟基维生素D，而后在肾脏中被转化为1,25-双羟基维生素D，这是维生素D发挥作用的生物活性成分。但循环中的1,25-双羟基维生素D含量极少，半衰期仅有4h，而循环中的25-羟基维生素D含量是1,25-双羟基维生素D的1000倍，是维生素D在循环中的主要存在形式，半衰期3周，能够反映人体维生素D的真实水平，是反映个体维生素D状态的最佳指标。维生素D及其代谢产物不溶于水，易溶于乙醇，且化学性质不稳定，容易在光照和湿热条件下发生分解。目前，国外体外诊断试剂生产企业研发的25-羟基维生素D校准品均为冻干品。冻干校准品存在以下缺点：生产工艺复杂，增加企业生产成本；使用前需要复溶，给操作带来不便；复溶过程中操作者操作误差可能对准确度带来影响，导致检测结果出现偏差；复溶后校准品不易保存。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种液态25-羟基维生素D校准品稀释液，该校准品稀释液配方可用于配制稳定的液态25-羟基维生素D校准品，并用于检测人血清中25羟基维生素D含量。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。所述环戊烷多氢菲类稳定剂为7-脱氢胆固醇、胆固醇、胆汁酸、麦角固醇、β-谷固醇中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.01-100mmol/L。所述环戊烷多氢菲类稳定剂优选采用7-脱氢胆固醇。所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Taps缓冲液、Mops缓冲液中的一种或任意两种以上混合液，缓冲液浓度为20-200mmol/L。所述防腐剂为Proclin300、MIT、Bro、IPBC、NaN3中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.1%-0.5%w/v。实际配制时，其配方为：PBS缓冲液20-500mmol/L，人血清白蛋白1%-10%w/v，Proclin3000.1%-0.5%w/v，7-脱氢胆固醇0.01-100mmol/L。四组分优选配方为：PBS缓冲液100mmol/L，人血清白蛋白3%w/v，Proclin3000.2%w/v，7-脱氢胆固醇2.0mmol/L。本专利技术提供了一种易于生产、便于操作并且可以使液态校准品稳定保存的校准品稀释液配方。使用该稀释液配方制备的校准品，在生产时无需进行冻干工序，缩短了生产周期，降低了生产成本；用户在使用时可直接将校准品加入仪器，无需经过复溶环节，避免了复溶时带来的准确度偏差；使用后的校准品仍可以稳定保存。本专利技术的主要创新之处在于：a)首次将7-脱氢胆固醇应用于25-羟基维生素D校准品稀释液，用于提升25-羟基维生素D在液态有氧条件下的稳定性；b)校准品稀释液中的所有组分均是最优配方，给25-羟基维生素D校准品的稳定性提供了有力保障，在2-8℃条件下可稳定保存12个月；c)将液态25-羟基维生素D校准品用于血清样品中25羟基维生素D的检测，检测时无需进行校准品复溶，且多次定标的校准曲线可重复性优于冻干校准品的校准曲线。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本专利技术实施例中所用的试剂和检测仪器均为本领域市售产品，所用检测方法均为本领域常规方法。实施例1配制液体25-羟基维生素D校准品稀释液称取一定量的7-脱氢胆固醇，然后将其溶解于少量无水乙醇中，再称量一定比例的人血清白蛋白、Proclin300，加入到100mmol/LPBS缓冲液中，搅拌30min，即配制成25-羟基维生素D校准品稀释液，其中含有人血清白蛋白3%w/v，Proclin3000.2%w/v，7-脱氢胆固醇2.0mmol/L。实施例2制备人血清样品中25羟基维生素D含量检测相关试剂1、制备25-羟基维生素D系列校准品取一定量的25羟基维生素D抗原，分别加入到实施例1制备的校准品稀释液中，配制成标示浓度为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、140ng/ml的一系列校准品，瓶盖颜色依次为白、黄、绿、蓝、红、紫、黑；2、制备包被有抗25羟基维生素D抗体的磁微粒混悬液根据使用量取适量的羧基磁微粒，用过量的EDC和NHS在酸性条件下进行活化，活化时间为30min，活化完成后，加磁场，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用PBS缓冲液洗涤两遍；加入适量的抗25羟基维生素D抗体，使其浓度为22μg/mg磁微粒，在0.05M-0.1M的MES缓冲液中（pH4.5-pH5.5）震荡反应1h；反应结束后加磁场，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的0.01M的PBS缓冲液（pH7.6）进行封闭，反复封闭5次；封闭结束后，加入适量的封闭液以保存磁微粒，将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；3、制备辣根过氧化物酶标记的25羟基维生素D将25羟基维生素D衍生物上的羧基与辣根过氧化物酶（HRP）分子的氨基经EDC的作用缩合为酰胺化合物，透析后即得酶标25羟基维生素D；在标记好的溶液中，等比加入甘油-20℃保存备用；将标记好的酶标25羟基维生素D按照1:2000--1:5000的比例加入到含有20%--50%小牛血清和PC300（0.15%-0.25%）的pH7.4Tris-NaCl缓冲液中，混合均匀，即得到该释放剂应用时使用的酶结合物；4、配制人血清25羟基维生素D释放剂称取十二烷基磺酸钠，然后将所述组分溶解于少量0.05MTris-NaCl缓冲液中，再加入一定比例的二甲基亚砜和乙醇，加入0.05MTris-NaCl缓冲液定容，用浓盐酸调整pH值至7.0；5、配制发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液发光底物A液由0.2MTris-Hcl、0.15mMLuminol、0.59mM羟基香豆素、0.35mM没食子酸配制而成；发光底物B液由0.85mM氨基酸氧化酶、0.8%Tween20、0.5mMDTPA、0.12mM维生素C配制而成；浓缩洗液由NaH2PO4·2H2O4.06g,Na2HPO4·12H2O62.32g,Tween202-10ml,蒸馏水1000ml配制而成。实施例3检测人血清样品中25羟基维生素D含量采用实施例2制备的相关试剂对人血清样品中25羟基维生素D含量进行检测，其具体步骤为：1、取出一定量的反应容器，编号。根据实验要求加入50μl校准/质控品/临床血清；2、摇匀磁微粒混悬液，每孔分别加入20μl；3、每孔分别加入酶标记物50μ；4、将反应容器内溶液混合均匀，37℃温育15分钟；5、使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液态25‑羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。

【技术特征摘要】
1.一种液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。2.根据权利要求1所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述环戊烷多氢菲类稳定剂为7-脱氢胆固醇、胆固醇、胆汁酸、麦角固醇、β-谷固醇中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.01-100mmol/L。3.根据权利要求2所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述环戊烷多氢菲类稳定剂为7-脱氢胆固醇。4.根据权利要求1所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Taps缓冲液、Mops缓冲液中的一种或任意两种以上混合液，缓冲液浓度为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：任永茂，靳增明，张玉娇，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41