本发明专利技术公开禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT‑PCR检测的引物，包括3对特异性引物，分别为引物对1：H5‑F和H5‑R，引物对2：H7‑F和H7‑R，引物对3：H9‑F和H9‑R，其分别具有有序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的碱基序列。针对当前流行的H5、H7、H9三种亚型的禽流感病毒的HA基因，经序列比对，设计了三对特异性引物，组合成禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT‑PCR检测试剂盒，同时采用反转录和PCR扩增一步法反应，扩增结束后通过琼脂糖凝胶电泳直观地得到检测结果，可以一管中简便快速的检测出H5、H7、H9三种亚型的病原，从而进行禽流感亚型鉴别。
【技术实现步骤摘要】
禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物及试剂盒
本专利技术属于RT-PCR检测试剂盒
，具体涉及到禽流感病毒目前流行的H5、H7、H9三种亚型的三重RT-PCR检测引物组、体系配比以及试剂盒及其应用。
技术介绍
禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)属于正粘病毒科甲型流感病毒属成员，为单股分节段负链RNA病毒。根据病毒囊膜表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，禽流感病毒可分为多个血清亚型，目前已发现有18种HA和11种NA。病毒基因组为8个独立的RNA片段，每一条RNA片段都是以不同的核糖核酸蛋白复合体形式存在。其中RNA片段4编码血凝素(HA)，它是AIV基因组中变异率最大的一个片段，不同亚型病毒以及同一亚型不同毒株之间均有很大差异。至今为止，从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，高致病性禽流感可引起鸡群100％死亡。禽流感病毒除了可以感染禽类外，部分亚型也能感染人，如H5、H7、H9三种。鸡是H5、H7、H9亚型禽流感病毒感染的主要宿主，禽流感历来被认为是人流感病毒发生变异的新基因来源，更突出显示了禽流感的公共卫生意义。目前，急需建立一种快速分型检测H5、H7、H9三种亚型禽流感病毒的方法及相应的试剂盒研制。中国CN200410010805.0号专利公开一种禽流感病毒反转录聚合酶链式反应检测方法及试剂盒，属于生物
，特别是涉及一种禽流感病毒检测的方法。本专利技术目的在于建立了禽流感病毒通用型RT-PCR检测方法和H5、H7、H9亚型分型检测的三重RT-PCR检测方法，最终组装成禽流感病毒(AvianInfluenzaVirusAIV)系列RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒在检测过程中污染风险较高。中国CN200410027815.5号专利用于高致病性禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测的核苷酸引物、探针序列和方法；涉及高致病性禽流感H5、H7和H9核苷酸片断的RT-PCR扩增引物和探针及其互补序列，以及同时进行禽流感H5、H7和H9亚型的分型检测方法。该方法成本较高，且检测结果不能直接读出，结果观测不直观。由于禽流感病毒具有多个亚型且变异快，疫情的发生情况又较复杂，所以迫切需要建立一种特异性好、敏感性高、准确可靠、快速简便的高致病性禽流感“一步法”分型检测方法，用于快速检测国内外主要流行的高致病性禽流感病毒亚型，从而满足进出口检验检疫和疫病监控的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物及试剂盒及其应用，针对当前流行的H5、H7、H9三种亚型的禽流感病毒的HA基因，经序列比对，设计了三对特异性引物，组合成禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测试剂盒，可以一管检测出H5、H7、H9三种亚型的病原，从而进行禽流感亚型鉴别。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物，包括3对特异性引物，分别为引物对1：H5-F和H5-R，引物对2：H7-F和H7-R，引物对3：H9-F和H9-R，其分别具有序列表SEQIDNO.1至SEQIDNO.6的碱基序列。本专利技术针对当前流行的H5、H7、H9三种亚型的禽流感病毒的HA基因，经序列比对，设计了三对特异性引物，引物对之间序列保守，不会发生交叉反应且特异性、灵敏度高。所述的3对引物对的组合为经过大量实验比对后获得，并非简单的针对三个亚型各自的引物放在一起就可以达到本专利技术所述检测的目的，如果将现有的针对三个亚型各自的引物进行组合很可能会出现交叉反应导致无法获得准确的检测结果。优选地，所述引物对1、引物对2、引物对3在RT-PCR检测的引物体系中的摩尔数配比为2:1:1。优选地，所述引物对1：H5-F和H5-R，在所述的RT-PCR检测的引物体系中的终浓度为0.8uM，所述引物对2：H7-F和H7-R在所述的RT-PCR检测的引物体系中的终浓度为0.4uM，所述引物对3：H9-F和H9-R在所述的RT-PCR检测的引物体系中的终浓度为0.4uM。本专利技术还提供禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒由上述引物、RT-PCR反应液、混合酶液、DEPC水组成。所述检测试剂盒使用时同时采用反转录和PCR扩增一步法反应，扩增结束后通过琼脂糖凝胶电泳直观地得到检测结果，可以一管中简便快速的检测出H5、H7、H9三种亚型的病原，从而进行禽流感亚型鉴别优选地，在每25uL的RT-PCR反应体系中，所述RT-PCR反应液包含2×OneStepMix12.5uL，10uMH5-F和H5-R引物各2uL，10uMH7-F和H7-R引物各1uL，10uMH9-F和H9-R引物各1uL。优选地，在每25uL的RT-PCR反应体系中，所述混合酶液包含反转录酶0.5uL、TaqDNA聚合酶1uL。所述禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测试剂盒的应用，RT-PCR反应条件为：50℃反转录10min，94℃预变性3min，进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环，最后再经72℃延伸7min后结束扩增。禽流感病毒H5、H7、H9三重RT-PCR检测试剂盒在扩增体系上使用特异性引物、逆转录和PCR反应在一管内完成。体系配比包括：3组引物、RT-PCR反应液、混合酶液、DEPC水；在每25uL的RT-PCR反应体系中，RT-PCR反应液每管20.5uL，包含2×OneStepMix12.5uL，10uMH5-F和H5-R引物各2uL，10uMH7-F和H7-R引物各1uL，10uMH9-F和H9-R引物各1uL；混合酶液OneStepEnzymeMix每管1.5uL，包含反转录酶0.5uL，TaqDNA聚合酶1uL。在实际应用中，RT-PCR反应液中的引物组三对引物在体系中的摩尔数配比为2：1：1，引物对1中的两条引物终浓度均为0.8uM，引物对2中的两条引物终浓度均为0.4uM，引物对3中的两条引物终浓度均为0.4uM。上述用量均可以根据实际需要扩大比例。对待检样品进行一步法RT-PCR扩增，待检样品可以是RNA。扩增程序上反转录温度在50℃，扩增10min，PCR扩增的退火温度控制在55℃为最佳，延伸时间为30s，常规35个循环即可得到很高的扩增产量。专利技术人专门针对H5亚型禽流感的HA基因、H7亚型禽流感的HA基因、H9亚型禽流感的HA基因，经序列比对，NCBI-Blast验证，设计了三对特异性引物，组合成H5亚型、H7亚型、H9亚型三重RT-PCR检测试剂盒，可以在一管中分型检测出禽流感病毒H5、H7、H9三个亚型，特异性强，敏感性好，同时采用反转录和PCR反应一步法反应，扩增结束后可以通过琼脂糖凝胶电泳简便快速直观地得到检测结果。利用本专利技术的引物对、试剂盒，可以检测出样品中H5亚型、H7亚型、H9亚型禽流感病毒的感染，对有效防控禽流感和切断传播途径有重要的公共卫生学意义。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)专利技术人针对当前流行的H5、H7、H9三种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT‑PCR检测的引物，其特征在于，包括3对特异性引物，分别为引物对1：H5‑F和H5‑R，引物对2：H7‑F和H7‑R，引物对3：H9‑F和H9‑R，其分别具有序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的碱基序列。
【技术特征摘要】
1.禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物，其特征在于，包括3对特异性引物，分别为引物对1：H5-F和H5-R，引物对2：H7-F和H7-R，引物对3：H9-F和H9-R，其分别具有序列表SEQIDNO.1至SEQIDNO.6的碱基序列。2.根据权利要求书1所述的禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述引物对1、引物对2、引物对3在RT-PCR检测的引物体系中的摩尔数配比为2:1:1。3.根据权利要求书1所述的禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述引物对1：H5-F和H5-R，在所述的RT-PCR检测的引物体系中的终浓度为0.8uM，所述引物对2：H7-F和H7-R在所述的RT-PCR检测的引物体系中的终浓度为0.4uM，所述引物对3：H9-F和H9-R在所述的RT-PCR检测的引物体系中的终浓度为0.4uM。4.禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：马磊，邹维华，但汉并，周云朵，范俊青，贾慧勤，李盼盼，张弛，董晓辉，徐高原，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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