基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测虫媒病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒的方法，属于出入境卫生检验检疫范畴，包括以下步骤：(1)设计各病毒的锁式探针与通用引物；(2)优化超分支滚环扩增条件，建立特异、准确的日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒超分支滚环扩增检测技术体系；(3)将3种虫媒病毒的检测探针交联于硝酸纤维素膜，实现对病毒超分支滚环扩增产物的特异性检出，成功研发了检测几种虫媒病毒的超分支滚环扩增试纸条，不仅确保检测的特异性和灵敏度，而且缩短检测时间、提高通关速度，对于提高入境卫生疫情截获、保护我国人民生命安全、加快口岸通关速度、降低检测成本都具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测虫媒病毒的方法
本专利技术涉及一种虫媒携带传染病检测
，特别是涉及一种基于超分支滚环扩增试纸条检测多种虫媒病毒的方法，属于卫生检疫范畴。
技术介绍
目前，在我国口岸检测的重要传染病中，由蚊类为传播媒介的病毒病主要包括流行性乙型脑炎(又称日本脑炎)、登革热、基孔肯亚热、西尼罗热、黄热病等。其中日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)、登革病毒(Denguevirus，DENV)、西尼罗河病毒(Westnilevirus，WNV)、黄热病病毒(Yellowfevervirus，YFV)属于黄病毒科黄热病毒属，基孔肯亚病毒是披膜病毒科甲病毒属成员，这五种病毒均是RNA病毒，基因结构非常相似。同时这五种病毒共享媒介载体，日本脑炎病毒和西尼罗病毒的传播媒介主要是库蚊，登革病毒和黄热病病毒的传播媒介主要是伊蚊，库蚊和伊蚊均可传播基孔肯亚病毒，导致这几种病毒具有高度重叠的地理分布。对于感染者来说，这几种病毒病表现出相似的临床特征(高热，皮疹，关节疼，神经症状等)和流行病学特点，常常需要实验室同时对这几种病毒进行检测以完成鉴别诊断。因此，建立针对同一份样品几种病原的快速，准确检测方法对于口岸传染病监测和防控十分必要。当前，对媒介携带虫媒病毒或者出入境疑似病人虫媒病毒病的筛查主要依靠酶联免疫学方法和实时荧光RT-PCR方法。由于黄病毒科病毒抗体存在严重的交叉反应，酶联免疫学方法在检测这些病毒病时的准确性不够，需要进行多病毒感染排除；实时荧光RT-PCR虽然特异性和敏感性高，但样品前处理繁琐费时，实验周期长；需要特殊的仪器(实时定量PCR仪)，检测成本高；在一个反应体系中只能对一种病原进行鉴定，检测效率低；且需要专门的分析技术人员，检测场所也局限于有条件的实验室中，不能满足现场快速检测的需要。建立快速、灵敏、操作简便、无需仪器的检测方法对于口岸检验检疫人员现场检疫工作具有高度的意义。超分支滚环扩增技术(hyper-branchedrollingcircleamplification，HRCA)，是一种借鉴自然界中环状病原生物体DNA分子滚环式的复制方式建立的核酸扩增技术，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数扩增，具有与环介导等温扩增(LAMP)技术相同的快速、灵敏、特异等特点。并且可以通过特异性的检测探针，构建基于目视判别颜色变化的可视化快速检测试纸条对超分支滚环扩增产物进行直观、快速判断。该技术即可以通过核酸扩增保证检测的特异性和敏感性，又通过固相化的检测探针，实现直观性和简便性，非常适合用于基层和现场检测目的。目前该技术在虫媒病原体检测领域中的应用还处于空白，有很大的应用前景。
技术实现思路
为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，所述的几种虫媒病毒包括日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒。本专利技术根据三种虫媒病毒的保守基因片段，依据锁式探针的设计原则设计三种虫媒病毒的锁式探针，锁式探针和靶标序列杂交后其两端的检测序列在空间位置上彼此相邻，在连接酶的作用下，形成一个环状的DNA分子；生物素标记的通用引物GF1和GR1可与这个环状单链DNA分子上的pNAK1序列区域的3’端和5’端结合，生成的延伸产物就是这个环状DNA模板分子的互补配对产物的多个连接，并在两端标记上生物素；扩增产物可特异的与固定在硝酸纤维素膜上的检测探针结合，最后与HRP-标记的亲和素反应，TMB显色，有肉眼可见的颜色反应表明有靶片段存在。一种基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，具体包括以下步骤(1)获取病毒DNA模板日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸由山东出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心实验室提供；以日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸序列为模板，分别设计三种病毒的扩增引物，分别为：日本脑炎病毒JEV-F5’-GCATCAAACAGCATATTGACACC-3’产物150bpJEV-R5’-GGCGCTCTGTGCCTAGTAGC-3’登革病毒DFV-F5’-AAGCTTCGAAAGCCACGGTTTGAGCA-3’产物300bpDFV-R5’-GCGGCCGCTCCATTTTCTGGCGTTCTGT-3’基孔肯亚病毒CHIKV-F5’-TAGAGCAGGAAATTGATCCC-3’产物354bpCHIKV-R5’-CTTTAATCGCCTGGTGGTAT-3’配制逆转录反应(RT-PCR)体系：对各自的基因进行RT-PCR扩增，采用onestepRT-PCR试剂盒(TAKARA)，反应体系如下：上/下游引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL，PrimeScript1StepEnzymemix1μL，2×1stepbuffer12.5μL，添加dH2O至终体积25μL；逆转录反应(RT-PCR)条件：50℃逆转录反应30min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应10min，循环反应35次；72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，大小与目的条带一致即为日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒DNA核酸模板；(2)锁式探针的设计锁式探针为两端为特异性识别序列、中间为连接序列的单链DNA，分别根据三种虫媒病毒的保守基因的片段序列设计锁式探针的特异性识别序列，两端特异性识别序列中间的连接部分为进行适当修改的pNAK1质粒中的一段核酸序列，锁式探针5’端磷酸化；当虫媒病毒为登革病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：CGAAAGCCACGGTTTGAGCAAGCCGTGCTGCCTGTAGCTCCATCGTGGGGATGTAAAAACCTGGGAGGCTGCAAACCATGGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCCCAAAACACAACGCAGCAGCGGGGCCCAACACCTGGGAAAGCTGTACCCTGGTGGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCATAACAATAAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCAGAAAATGGA；锁式探针为：5’-phosphate-A(ACAGCAGGATCTCTGGTCTCTCCtgctgaatccgttagccagcagccgcctcgacgaatttctgccattcatccccttattatcacttatTGCCTGGAATGATGCTGTAG-3’，单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；当虫媒病毒为乙脑病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：catttgcatcaaacagcatattgacacctgggaatagactgggagatcttctgctctatctcaacatcagctactaggcacagagcgccgaagtatgtagctggtggagaggaagaacacaggatct；锁式探针为：5’-phosphate-TG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获取病毒DNA模板日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸由山东出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心实验室提供；以日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸序列为模板，分别设计三种病毒的扩增引物，分别为：日本脑炎病毒JEV‑F 5'‑GCATCAAACAGCATATTGACACC‑3'      产物150bpJEV‑R 5'‑GGCGCTCTGTGCCTAGTAGC‑3'登革病毒DFV‑F 5'‑AAGCTTCGAAAGCCACGGTTTGAGCA‑3'       产物300bpDFV‑R 5'‑GCGGCCGCTCCATTTTCTGGCGTTCTGT‑3'基孔肯亚病毒CHIKV‑F 5'‑TAGAGCAGGAAATTGATCCC‑3'       产物354bpCHIKV‑R 5’‑CTTTAATCGCCTGGTGGTAT‑3’配制逆转录反应(RT‑PCR)体系：对各自的基因进行RT‑PCR扩增，采用onestep RT‑PCR试剂盒(TAKARA)，反应体系如下：上/下游引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL，PrimeScript 1Step Enzymemix1μL，2×1step buffer 12.5μL，添加dH2O至终体积25μL；逆转录反应(RT‑PCR)条件：50℃逆转录反应30min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应10min，循环反应35次；72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，大小与目的条带一致即为日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒DNA核酸模板；(2)锁式探针的设计锁式探针为两端为特异性识别序列、中间为连接序列的单链DNA，分别根据三种虫媒病毒的保守基因的片段序列设计锁式探针的特异性识别序列，两端特异性识别序列中间的连接部分为进行适当修改的pNAK1质粒中的一段核酸序列，锁式探针5’端磷酸化；当虫媒病毒为登革病毒时，锁式探针为：...

【技术特征摘要】
1.一种基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获取病毒DNA模板日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸由山东出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心实验室提供；以日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸序列为模板，分别设计三种病毒的扩增引物，分别为：日本脑炎病毒JEV-F5'-GCATCAAACAGCATATTGACACC-3'产物150bpJEV-R5'-GGCGCTCTGTGCCTAGTAGC-3'登革病毒DFV-F5'-AAGCTTCGAAAGCCACGGTTTGAGCA-3'产物300bpDFV-R5'-GCGGCCGCTCCATTTTCTGGCGTTCTGT-3'基孔肯亚病毒CHIKV-F5'-TAGAGCAGGAAATTGATCCC-3'产物354bpCHIKV-R5’-CTTTAATCGCCTGGTGGTAT-3’配制逆转录反应(RT-PCR)体系：对各自的基因进行RT-PCR扩增，采用onestepRT-PCR试剂盒(TAKARA)，反应体系如下：上/下游引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL，PrimeScript1StepEnzymemix1μL，2×1stepbuffer12.5μL，添加dH2O至终体积25μL；逆转录反应(RT-PCR)条件：50℃逆转录反应30min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应10min，循环反应35次；72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，大小与目的条带一致即为日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒DNA核酸模板；(2)锁式探针的设计锁式探针为两端为特异性识别序列、中间为连接序列的单链DNA，分别根据三种虫媒病毒的保守基因的片段序列设计锁式探针的特异性识别序列，两端特异性识别序列中间的连接部分为进行适当修改的pNAK1质粒中的一段核酸序列，锁式探针5’端磷酸化；当虫媒病毒为登革病毒时，锁式探针为：单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；当虫媒病毒为乙脑病毒时，锁式探针为：单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，锁式探针为：单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；(3)通用引物的设计根据锁式探针两端特异性识别序列中间的连接部分的序列，设计两条扩增方向相反的通用引物GF1和GR1，引物GF1和GR1的5’端修饰有生物素(biotin)，通用引物序列为：GF15'-biotin-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’24bpGR15'-biotin-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’21bp(4)检测探针的设计设计检测探针序列，检测探针序列为锁式探针两特异性末端与模板相结合的衔接区域，检测探针序列5’端含有多聚核苷酸T；当虫媒病毒为登革病毒时检测探针为：5’-TTTTTTAGATCCTGCTGTCTCTACA-3’；当虫媒病毒为乙脑病毒时检测探针为：5’-TTTTTTCTGCTCTATCTCAACATC-3’；当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时检测探针为：5’-TTTTTTGGAAAAGTCCTGGACAGA-3’；(5)锁式探针连接反应锁式探针连接反应体系：浓度为1nmol/L～10μmol/L的锁式探针1μL，T4DNA连接酶1U/μL，其商品配套的10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，样品模板2μL，加去离子水至反应总体积为10μL；锁式探针连接反应条件：94℃反应5min后迅速置于冰上，2min后加T4DNA连接酶，37℃条件下连接反应20～60min，最后65℃10min终止连接反应；(6)超分支滚环扩增(HRCA)反应HRCA反应体系：dNTPs0.4mmol/L，GF10.4μmol/L，GR10.4μmol/L，Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，0.1％TritonX-100，2μL连接产物与8UBstDNA聚合酶大片段，加dH2O使反应体系总体积为25μL；HRCA反应条件：60℃扩增20～80min后，95℃10min终止反应；扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，若条带呈阶梯状，则表示该样品为目的病毒阳性，反之为阴性；(7)检测探针结合试纸条的制备将17μL变性液与3μL检测探针于室温下混匀5min，取5μL混合液点于硝酸纤维素膜上，室温晾干，每个点样点可重复点样3次；UV光源下(波长254nm，强度60～120mJ/cm2)照射使检测探针固定在膜上；37℃条件下，用脱脂奶粉(5g...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑾，徐翮飞，薛晓宁，张娟，徐颖，
申请(专利权)人：山东国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：山东,37