本发明专利技术涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的RPA‑LED可视化试剂盒。本发明专利技术提供了检测猪流行性腹泻病毒的重组酶聚合酶等温扩增引物组，包括序列如SEQ ID NO：1‑3所示的上游引物、下游引物和探针。还提供了检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂，包括重组酶聚合酶、dNTPs和所述的引物组。另外提供了检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，所述试剂盒含有所述的引物组或所述的试剂。本发明专利技术检测试剂盒的特异性强，灵敏度高，且结果便于观察，不需要复杂设备，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测猪流行性腹泻病毒。
【技术实现步骤摘要】
检测猪流行性腹泻病毒的RPA-LED可视化试剂盒
本专利技术涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的RPA-LED可视化试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的急性肠道传染病，主要临床特征为腹泻、呕吐和脱水，其临床症状、病理变化与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)极其相似难以区分。PEDV感染可发生于不同年龄段的猪，其中感染最严重的是仔猪，发病率和死亡率常达100％。PEDV在我国猪群中一直广泛传播，2010年10月，由于PEDV变异引发了PED在我国大规模的爆发，造成大量仔猪死亡，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒，在分类地位上隶属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)I群，与猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcinerespiratorycoronavirus，PRCoV)、人冠状病毒229E同属。PEDV粒子呈多形性，大多数呈球形，直径大小为95～190nm(平均直径约为130nm)囊膜上分布着长度为18～23nm的纤突，由内向外呈放射状排列。PEDV的基因组全长约为28kb，5’端非编码区(5’-untranslatedregion，UTR)有帽子结构，3’端有poly(A)尾巴和至少7个开放阅读框(ORF)，同时有编码S、E、N、M基因的4个结构蛋白和ORF1a、ORF1b以及ORF3基因的3个非结构蛋白。整个基因组从5’到3’的顺序依次为：5’-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’。Duarte等通过研究证实了PEDV各蛋白片段的大小，其中编码非结构蛋白的ORF(1a和1b)占到整个基因组的三分之二大小的长度，而编码基因组结构蛋白的S蛋白为150～220kDa、E蛋白为7kDa、M蛋白为20～30kDa、N蛋白为58kDa，ORF3是一种调节基因，编码一种辅助蛋白。1971年英国首次报道PEDV，随后欧洲几个国家相继出现了类似的病毒性腹泻，1978年在比利时首次分离到PEDV并将其命名为CV777株。PED主要发生在冬、春寒冷季节，病猪和潜伏感染猪呕吐物和腹泻粪便中含有大量病毒为该病的主要传染源，可通过直接接触进行传播。当猪场发生PEDV感染时主要通过粪-口途径进行传播，不同年龄和品种的猪都能受到感染并表现不同程度的症状，但仔猪的病情尤其严重死亡率可高达100％。2000年以来，欧洲已少有爆发急性，但该疾病在包括中国、韩国和日本在内的亚洲国家中的流行却愈发的严重起来。由于PED与TGE、轮状病毒病、大肠杆菌等肠道感染性疾病的相似性，尤其是PEDV与TGEV两种病毒，仅仅通过临床症状和病理变化几乎不能特异性区分，因此实验室诊断对于PEDV的确诊是十分必要的。目前用于猪流行性腹泻病毒的检测方法主要包括病原学诊断，血清学方法和分子生物学方法。病毒分离鉴定是传统的检测方法，但是耗时较长，不适合于大批样品的检测。常用的血清学诊断方法主要有：酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、微量血清中和试验等，特异性强，结果真实可靠，但是实际操作中费时费力，敏感性较低且易有交叉污染，因此在临床应用过程中有一定的局限性。而RT-PCR、荧光定量PCR检测方法虽然操作简便，特异性强，敏感性高，但需要相关的仪器设备，并对技术人员的操作技能和分析能力要求较高。重组酶聚合酶等温扩增技术(RecombinasePloymeraseAmplication,RPA)是一种新型核酸等温扩增技术，经过研究人员的努力，RPA技术已经获得了快速的发展。RPA产物检测方法主要分为三种：凝胶电泳检测、实时荧光RPA(real-timeRPA)和核酸试纸条RPA。其中凝胶电泳检测是RPA扩增与琼脂糖凝胶检测技术相结合，即将RPA扩增产物经过商品试剂盒纯化后直接用琼脂糖凝胶电泳进行检测，与LAMP技术相比该过程仅需要一对引物即可完成对目的片段的扩增。实时荧光RPA是基于荧光标记探针的检测方法，通过观察荧光信号的强度来达到对扩增产物的实时监控。RPA技术在基因扩增方面具有很大的优势，但引物设计比较复杂。以上这些方法的不足限制了在基层和临床检测中的推广应用。鉴于此，迫切需要建立一种快速、简便、准确的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒的重组酶聚合酶等温扩增引物组。所述引物组包括序列如SEQIDNO：1-3所示的上游引物、下游引物和探针。具体的，序列如下：上游引物：5'-Biotin-ACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCA-3'(SEQIDNO：1)下游引物：5'-CTTACCTGTACGCCAGTAGCAACCTTATAG-3'(SEQIDNO：2)探针：5'-FAM-GATTGAAAGACCACCAAGAATGTGTCCTGC-THF-CCACAACCGAATGCT-C3spacer-3'(SEQIDNO：3)。所述上游引物和所述下游引物的终浓度为15-420nM。所述探针的终浓度为5-120nM。本专利技术的第二个目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂，包括重组酶聚合酶、dNTPs和权利要求1所述的引物组。本专利技术的第三个目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的引物组，或如上所述的试剂。所述试剂盒还包括水解缓冲液和醋酸镁溶液。优选的，所述醋酸镁溶液为280mM醋酸镁溶液。所述试剂盒包括核酸检测试纸条。优选的，所述核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。所述试剂盒包括全封闭式靶核酸快速检测装置。所述全封闭式靶核酸快速检测装置通过将核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。本专利技术第四个目的是提供如上所述的试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测的方法，包括以下步骤：S1、配制反应体系：将上游引物、下游引物、探针、水解缓冲液、待检测样品和水混匀后加至重组酶聚合酶里面，反复吹打混匀，然后加入醋酸镁溶液得到反应混合物；S2、将步骤S1中得到的反应混合物在恒温下反应；S3、将步骤S2恒温反应后的产物用核酸检测试纸条进行检测并观察结果；S4、结果判定：直接肉眼判读。判断标准为：阴性：试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带。阴性结果表明样本中不含目的核酸片段，或其数量低于试纸条的最低检测限；阳性：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)。阳性结果表明样本中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量，即所检测的样本感染了猪流行性腹泻病毒；无效：试纸条质控区(C线)和检测区(T线)均未出现条带，提示所用的试纸条和反应试剂可能已经损坏、失效或者操作有误。在一个具体实施例中，上述S本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测猪流行性腹泻病毒的重组酶聚合酶等温扩增引物组，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO：1‑3所示的上游引物、下游引物和探针。
【技术特征摘要】
1.检测猪流行性腹泻病毒的重组酶聚合酶等温扩增引物组，其特征在于，包括序列如SEQIDNO：1-3所示的上游引物、下游引物和探针。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的终浓度为15-420nM。3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的终浓度为5-120nM。4.检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂，包括重组酶聚合酶、dNTPs和权利要求1所述的引物组。5.检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任意一项所述的引物组，或权利要求4所述的试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括水解缓冲液和醋酸镁溶液。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸检测试纸条。8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵明秋，李晓明，张静远，张媛媛，易琳，陈金顶，丁红星，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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