本发明专利技术公开了一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物对及其检测方法，属于植物病原真菌检测领域，自行设计合成了1套引物(Fot‑F3、Fot‑B3、Fot‑FIP和Fot‑BIP)。优化反应体系及扩增程序，建立了一种特异性强、快速准确并且可视化的植物及植物产品中郁金香基腐病菌基因组DNA的检测方法，一个工作日内完成整个检测，用于对郁金香基腐病菌的LAMP可视化检测。
【技术实现步骤摘要】
郁金香基腐病菌LAMP可视化检测方法
本专利技术涉及使用LAMP技术检测植物及植物产品中郁金香基腐病菌的方法，属于植物病原真菌检测领域。
技术介绍
郁金香基腐病菌（Fusariumoxysporumf.sp.tulipae）能够引起的郁金香种球腐烂病害。病害发生在种球储藏期和生长早期，导致种球和植株的腐烂死亡，失去经济价值。郁金香基腐病能够土壤传播，病害一旦传入很难根除，远距离传播主要靠带菌的郁金香种球，在运输和储藏过程中，种球间的挤压接触也能造成病害传播。郁金香基腐病菌引起的病害在郁金香种植生产中危害严重，是近年来我国进境口岸重点关注的病害之一。郁金香基腐病菌也被称为尖镰孢菌郁金香专化型病菌（Fusariumoxysporumf.sp.tulipae），镰刀菌属的真菌在分类鉴定方面主要通过观察菌落、分生孢子、分生孢子梗、厚垣孢子的有无等形态特征来进行鉴定。病原菌菌株培养时间需约7天才能观察相关形态特征，镰刀菌属真菌在形态鉴定方面具有较大难度，需要鉴定人员具有较高的专业水平。目前的检测方法不能满足口岸检测“快验快放”的要求，尤其对于基层部门现场开展的检测工作。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法。该技术与PCR相比优势明显，除了高特异性和高灵敏度外，实验操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅就能实现整个检测过程，适合高通量的病原微生物检测。同时，该技术抗干扰能力较强，使用的样品可以是未经提纯处理的，为基层部门现场开展检测工作提供了很好的技术支持。目前还没有将LAMP技术应用于郁金香基腐病菌检测的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：设计郁金香基腐病菌的LAMP特异引物，建立郁金香基腐病菌的LAMP可视化检测方法。为了解决该问题，本专利技术的解决方案是，设计郁金香基腐病菌的特异LAMP引物，用于郁金香基腐病菌基因组DNA的特异性检测。郁金香基腐病菌的LAMP特异引物，序列如下：Fot-F3:5’-ACCTGATCCGAGGTCAACATFot-B3:5’-CAGTATTCTGGCGGGCATGFot-FIP:5’-CACGTCGAGCTTCCATAGCGT-AGAAGTTGGGGTTTAACGGCFot-BIP:5’-TGAGGAACGCGAATTAACGCGA-GTTCGAGCGTCATTTCAACC反应结束后，在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变。一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途，包括下述的扩增体系和扩增程序：（1）扩增体系总反应体系为25μL，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL、2.5mmol/LdNTPs2.5μL、100mmol/LMgSO41μL、10mmol/LPH-FIP1.6μL、10mmol/LPH-BIP1.6μL、10mmol/LPH-F30.2μL、10mmol/LPH-B30.2μL、8U/μLBstDNAPolymerase1μL、DNA模板1μL，加dH2O补足至25μL。（2）反应程序63℃在水浴锅中反应70min，之后在85℃下灭活5min。扩增产物中加入1μLSYBRGreenI荧光染料进行染色反应。一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物可视化检测方法。本专利技术的有益效果是：建立了方法简便的郁金香基腐病菌的LAMP特异性引物，通过提取病组织的DNA，能够检测病组织中的郁金香基腐病菌。简化和方便了对该病原菌的检测，节约了检测时间，该方法快速、可靠，可在基层部门现场开展的检测工作。附图说明图1是郁金香基腐病菌的LAMP特异引物的扩增(郁金香基腐病菌及对照菌的LAMP电泳图：M.DNAMarkerDL2000；1-14：菌株S0122、P10312、P12005、P101、P102、Y01、Y02、Y03、T034、YN-1、L09.11、0917、39、13903；15.阴性对照；16.空白对照)。图2是SYBRGreenI荧光染料显色图(LAMP显色反应)。具体实施方式本专利技术的郁金香基腐病菌LAMP特异引物，实现了郁金香基腐病菌的快速检测。设计郁金香基腐病菌的特异LAMP引物，序列如下：Fot-F3:5’-ACCTGATCCGAGGTCAACATFot-B3:5’-CAGTATTCTGGCGGGCATGFot-FIP:5’-CACGTCGAGCTTCCATAGCGT-AGAAGTTGGGGTTTAACGGCFot-BIP:5’-TGAGGAACGCGAATTAACGCGA-GTTCGAGCGTCATTTCAACC反应结束后，在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变。本专利技术建立一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物对及其扩增方法，包括扩增体系的建立和扩增程序设立：（1）扩增体系总反应体系为25μL，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL、2.5mmol/LdNTPs2.5μL、100mmol/LMgSO41μL、10mmol/LPH-FIP1.6μL、10mmol/LPH-BIP1.6μL、10mmol/LPH-F30.2μL、10mmol/LPH-B30.2μL、8U/μLBstDNAPolymerase1μL、DNA模板1μL，加dH2O补足至25μL。（2）反应程序63℃在水浴锅中反应70min，之后在85℃下灭活5min。扩增产物中加入1μLSYBRGreenI荧光染料进行染色反应。本专利技术设计合成郁金香基腐病菌的LAMP特异性引物，对所有实验材料菌丝DNA及病组织中的郁金香基腐病菌进行质量检测，避免假阴性。所述检测郁金香基腐病菌的LAMP引物对及其扩增方法。本专利技术设计了郁金香基腐病菌的LAMP特异性引物，建立了郁金香基腐病菌的检测方法。通过提取病组织的DNA，能够检测病组织中的郁金香基腐病菌。简化和方便了对该病原菌的检测，节约了检测时间，该方法快速、可靠，可在基层部门现场开展的检测工作。下面结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：实施例1：实验菌株本实验5株郁金香基腐病菌菌株分离自荷兰进境的郁金香种球，其他对照菌株共13株。实施例2：菌丝基因组DNA的提取将菌丝挑于1.5mL离心管，液氮研磨，再按照QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒提取DNA，并将DNA溶于100μL1×TE缓冲液中，置于-20℃保存。PCR扩增相关试剂为大连宝生物（TaKaRa）工程公司产品。3.1反应混合液的配置总反应体系为25μL，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL、2.5mmol/LdNTPs2.5μL、100mmol/LMgSO41μL、10mmol/LPH-FIP1.6μL、10mmol/LPH-BIP1.6μL、10mmol/LPH-F30.2μL、10mmol/LPH-B30.2μL、8U/μLBstDNAPolymerase1μL、DNA模板1μL，加dH2O补足至25μL。以郁金香基腐病菌的菌丝为阳性对照，无菌水为阴性对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物可视化检测方法，其特征在于，自行设计的郁金香基腐病菌的LAMP特异引物对，能够对郁金香基腐病菌进行分子生物学特异性检测，引物序列如下：Fot‑F3: 5’‑ ACCTGATCCGAGGTCAACATFot‑B3: 5’‑ CAGTATTCTGGCGGGCATGFot‑FIP:5’‑ CACGTCGAGCTTCCATAGCGT‑AGAAGTTGGGGTTTAACGGCFot‑BIP:5’‑ TGAGGAACGCGAATTAACGCGA‑GTTCGAGCGTCATTTCAACC引物用于植物及植物产品中郁金香基腐病菌基因组DNA的特异性检测。
【技术特征摘要】
1.一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物可视化检测方法，其特征在于，自行设计的郁金香基腐病菌的LAMP特异引物对，能够对郁金香基腐病菌进行分子生物学特异性检测，引物序列如下：Fot-F3:5’-ACCTGATCCGAGGTCAACATFot-B3:5’-CAGTATTCTGGCGGGCATGFot-FIP:5’-CACGTCGAGCTTCCATAGCGT-AGAAGTTGGGGTTTAACGGCFot-BIP:5’-TGAGGAACGCGAATTAACGCGA-GTTCGAGCGTCATTTCAACC引物用于植物及植物产品中郁金香基腐病菌基因组DNA的特异性检测。2.一种检测郁金香基腐病菌的LAMP扩增体系：总反应体系为25μL，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏，姜一，张莹，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津,12
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