一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全细胞转化生产4‑羟基异亮氨酸的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一段可用于编码L‑异亮氨酸羟化酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将此基因在枯草芽孢杆菌中进行表达，可使枯草芽孢杆菌能够高效合成比酶活高且4‑羟基异亮氨酸转化率高的L‑异亮氨酸羟化酶；将本发明专利技术的枯草芽孢杆菌工程菌培养12～24h，即可使粗酶液中的L‑异亮氨酸羟化酶的酶活高达171.67U/mL；利用本发明专利技术的的枯草芽孢杆菌工程菌生产得到的L‑异亮氨酸羟化酶比酶活和4‑羟基异亮氨酸转化率均较高，其中，比酶活可达437.6U/mg，4‑羟基异亮氨酸转化率可达99.87％。

【技术实现步骤摘要】
一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法
本专利技术涉及一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法，属于基因工程

技术介绍
4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine,4-HIL)最初是在一年生草本植物胡罗巴的种子中被发现的，它拥有80％的游离氨基酸，具有促胰岛素和抗肥胖的作用，可用于治疗糖尿病，并且，用4-羟基异亮氨酸治疗II型糖尿病可以避免很多不良反应和副作用，如治疗II型糖尿病时出现的低血糖现象。因此，4-羟基异亮氨酸是一种非常有前景的抗糖尿病药物。此外，随着人们对4-羟基异亮氨酸研究的不断深入，有研究发现，4-羟基异亮氨酸在调节血脂、降低胆固醇水平、抗感染、抗氧化、抗衰老、保护心脏等方面也有很好的疗效，这意味着，4-羟基异亮氨酸可在包括糖尿病在内的多种慢性疾病的治疗方面都起到很好的作用。因此，人们对4-羟基异亮氨酸的需求越来越多，4-羟基异亮氨酸的市场也越来越大。目前，4-羟基异亮氨酸的生产方法主要有以下3种：一是直接从胡罗巴中萃取分离；二是化学合成；三是酶法生物合成。其中，萃取分离法是先用乙醇对胡罗巴进行处理以萃取原料中的氨基酸，然后用离子交换树脂对萃取物进一步洗脱纯化以得到目标产物4-羟基异亮氨酸，这种方法虽然实现了4-羟基异亮氨酸的生产，但是，却存在材料受限、工艺复杂、分离成本高、得率低和纯度较低等诸多缺点，总收率不足1％，因此，这种方法不适合4-羟基异亮氨酸的大规模生产。化学合成法主要包括由Wang等提出的8步高效合成方法(具体可见文献：WangQ,OuazzaniJ,N.AndréSasaki,etal.APracticalSynthesisof(2S,3R,4S)ydroxyisoleucine,APotentInsulinotropicα〢minoAcidfromFenugreek[J].EuropeanJournalofOrganicChemistry,2002,2002(5):834-839.)、Rolland等提出的六步化学合成法(具体可见文献：ValérieRolland-Fulcrand,RollandM,RoumestantML,etal.ChemoenzymaticSynthesisofEnantiomericallyPure(2S,3R,4S)-4-Hydroxyisoleucine,anInsulinotropicAminoAcidIsolatedfromFenugreekSeeds[J].EuropeanJournalofOrganicChemistry,2004,2004(4):873-877.)以及Smirnov等提出的的两步合成法(具体可见文献：MetabolicengineeringofEscherichiacolitoproduce(2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine.[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology,2010,88(3):719.)，但是，利用这些方法生产4-羟基异亮氨酸的产率也不够高，仅有40％左右，并且，利用这些方法生产得到的4-羟基异亮氨酸还含有其他非(2S,3R,4S)-4-HIL构型的异构体，不利于后期纯化，因此，这种方法也不适合4-羟基异亮氨酸的大规模生产。酶法生物合成4-羟基异亮氨酸是通过将可产L-异亮氨酸羟化酶的菌株进行培养以获得L-异亮氨酸羟化酶，进而利用L-异亮氨酸羟化酶对底物进行转化以获得4-羟基异亮氨酸的，这种方法具有催化特异性强且简单高效的优势。现有的酶法生物合成主要有以下2种：一是利用L-异亮氨酸羟化酶生产菌株进行全细胞转化生成4-羟基异亮氨酸，二是以L-异亮氨酸产生菌进行改造并直接发酵来生产4-羟基异亮氨酸。其中，利用L-异亮氨酸羟化酶生产菌株进行全细胞转化生成4-羟基异亮氨酸的不足之处是需对L-异亮氨酸羟化酶进行诱导，添加诱导剂的用量和诱导时间不合适则可能形成大量包涵体，进而导致酶活低及4-羟基异亮氨酸的产量较低，例如，SenH等(具体可见文献：SenH,FengS.Directedevolutionandsite-specificmutagenesisofl-isoleucinedioxygenasederivedfromBacillusweihenstephanensis[J].BiotechnologyLetters,2018.)克隆了Bacillusweihenstephanensis来源的ido基因，得到了工程菌EcoliBL21/pET28a-ido，利用此工程菌一次性投加底物100mM，转化24h，仅可使4-HIL的产量达26.09±1.85mM4-HIL；HuangS等(具体可见文献：HuangS,ShiF.Directedevolutionandsite-specificmutagenesisofl-isoleucinedioxygenasederivedfromBacillusweihenstephanensis[J].BiotechnologyLetters,2018,40(19):1-9.)克隆了B.thuringiensisTCCC11826来源的ido，构建得到的工程菌E.coliΔsucAΔaceA/pWSK-ido，利用此工程菌一次性投加底物160mM，转化12h，仅可得到151.9mM4-HIL；而以L-异亮氨酸产生菌进行改造并直接发酵来生产4-羟基异亮氨酸的不足之处是发酵时间较长且产量依旧不高，例如，卢正珂等在产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达B.thuringiensisYBT1520来源的ido基因和mqo基因，发酵144h后，ido-mqo过表达菌的4-HIL产量是(60.86±2.24)mmol/L(具体可见文献：卢正珂,史锋.过表达mqo对重组谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸合成的影响[J].食品与发酵工业,2017(10):35-40.)。因此，现有的酶法生物合成也难以实现4-羟基异亮氨酸的大规模工业生产。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可高产L-异亮氨酸羟化酶且产得的L-异亮氨酸羟化酶比酶活高、4-羟基异亮氨酸转化率高的重组菌，以提高酶法生物合成4-羟基异亮氨酸的产率。[技术方案]本专利技术提供了一段可用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体、pHT01载体、pHT43载体、pBesT502载体、pET28a载体、pXMJ19载体、pET24b载体或pDXW-10载体。在本专利技术的一种实施方式中，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒是通过将pMA5载体与上述一段可用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因经限制性内切酶NdeI和MluI酶切后连接获得的。本专利技术还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一段用于编码L‑异亮氨酸羟化酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一段用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.携带权利要求1所述基因的重组质粒。3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，含有pMA5载体、pHT01载体、pHT43载体、pBesT502载体、pET28a载体、pXMJ19载体、pET24b载体或pDXW-10载体与权利要求1所述基因。4.携带权利要求1所述基因或权利要求2或3所述重组质粒的宿主细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。6.一种生产L-异亮氨酸羟化酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4或5所述的宿主细胞在培养基中进行培养。7.一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法为将权...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，乔郅钠，龙梦飞，徐美娟，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32