一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取与应用方法技术

本发明专利技术公开了一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取与应用方法，属于食品检测领域，通过改进鱼油(或鱼油与棕榈油混合样品)DNA的提取方法，获取得到较高质量的DNA。进一步利用16srRNA(动物源性)、DXS(棕榈油的特征基因)等分子的保守/特异序列在分子水平上对鱼油产品进行鉴定，判定鱼油中是否掺加棕榈油，从而对鱼油品质进行评价。本发明专利技术方法具有较强的特异性与灵敏性，0.01％浓度的棕榈油掺入鱼油中亦可特异性检出。该方法的灵敏性远胜于薄层色谱技术、光谱法、电导法以及质谱技术等各类化学方法。同时大大缩短了检测时间，降低了检测成本，具有无可比拟的优点，适宜大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取与应用方法
本专利技术属于食品检测领域，具体地涉及一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取与应用方法。
技术介绍
鱼油是指来自于除海洋哺乳动物之外的，经过处理的水生动物的油。是指鱼体内的全部油脂类物质的总成，富含ω-3型不饱和脂肪酸(ω-3PUFA),如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，属于必须不饱和脂肪酸。研究表明，ω-3型脂肪酸在防治心脑血管疾病、调节血脂、抗炎等方面具有独特的功效，对人体的营养和发育也具有重要作用。另外，鱼油是水产饲料的重要原料之一，饲料中添加鱼油可明显增加饲料能量，提高其利用率，水生生物的抗病能力也大大增强，促进其生长发育。近年来，鱼油的营养价值陆续被证实，以鱼油为主要原料的产品亦发展迅速，各国对鱼油的研究与应用日趋重视。一般来说，海洋原料鱼油经过简单的粗加工后主要用于水产及畜禽饲料，再进一步经过深度加工作为营养保健品或膳食补充剂进入食用领域。然而，由于鱼油的品质深受产地、季节及加工工艺等因素影响，再加上利益驱动，不法商贩往往存在掺假等行为，致使鱼油的质量参差不齐。根据近年来出现的鱼油掺假情况，掺入的多为大豆油、菜籽油、棕榈油等植物油以及其他矿物油等，肉眼较难判定。已有研究表明，当鱼油中棕榈油的添加剂量达到一定程度，可对肝脏的正常生理功能造成明显影响。另外，棕榈油饱和脂肪酸含量较高，也易造成血管淤堵等问题。可见，鱼油品质的鉴定尤为重要。一般说来，鉴定鱼油的常用技术有薄层色谱技术、光谱法、电导法以及质谱技术等，但多存在定量不够准确、灵敏度较低，较低剂量掺假油脂无法检出或者检测成本偏高等缺点。基于分子生物学的基因鉴定方法因具有良好的特异性、灵敏性以及成本较低等特点，从众多检测技术中脱颖而出，目前被广泛应用于食品原材料的鉴定。然而，由于鱼油的提取工艺涉及多道程序，初加工方法多为淡碱水解法或酶解法，然后进一步对粗提鱼油进行精炼，分为脱胶、脱酸、脱色以及脱臭等流程。而棕榈油也经过了水煮、碾碎、榨取以及精炼、氧化等多道程序。经过系列的深加工过程，油脂中的核酸破坏严重，DNA大多降解为小片段且含量较低。另外，油脂提取过程中使用的加工助剂会严重影响DNA的提取效率及纯度，干扰后续荧光定量PCR等分子生物学实验的鉴定。一直以来，油脂类样品DNA的提取都是一个难点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取与应用方法，通过改进鱼油(或鱼油与棕榈油混合样品)DNA的提取方法，获取得到较高质量的DNA。进一步利用16srRNA(动物源性)、DXS(棕榈油的特征基因)等分子的保守/特异序列在分子水平上对鱼油产品进行鉴定，判定鱼油中是否掺杂棕榈油，从而对鱼油品质进行评价。本专利技术是通过如下技术方案来实现：一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)水相制备：取鱼油样品、无菌ddH2o至于灭菌烧杯中，鱼油样品与无菌ddH2o的体积比为10：1，充分混匀后置于磁力搅拌器中搅拌1h，4℃条件下12000rpm离心2min，弃上层油脂，向下层水相再次加入相同体积的鱼油，重复上述操作3次，保存水相；(2)裂解消化：取2ml步骤(1)中的水相至离心管，加入等体积预热至65℃的CTAB裂解液与蛋白酶K，涡旋混匀，65℃温育30min，得样品裂解液；(3)分步抽提：对步骤(2)中的样品裂解液先使用等体积平衡酚进行抽提1次，对上清液再进一步使用等体积氯仿：异戊醇混合液抽提2次，所述混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24：1，得上清液，放置5min，然后4℃条件下12000rpm离心10min；(4)沉淀DNA：取步骤(3)中的上清液，加入0.8倍体积的-20℃预冷的异戊醇和0.1倍体积的3mol/lNH4Ac，颠倒混匀后全部转移至核酸纯化吸附柱，收集液于-20℃静置30min后再次转入核酸纯化吸附柱，取出吸附柱，弃去收集管内液体，用1ml体积分数为75％的乙醇溶液冲洗吸附柱，室温下静置5min，使乙醇充分挥发；随后将吸附柱取出放入新的离心管，向吸附柱中加入50μlTE溶液，静置3min，4℃条件下12000rpm离心1min，DNA溶液即被收集在离心管中。本专利技术还提供利用上述方法提取的DNA进行鉴别鱼油中掺杂棕榈油的方法，具体步骤如下:(1)用无菌ddH2o将DNA沉淀溶解，加入RNase酶，保存待用；选择16s-rRNA为内参引物，DXS为目的基因引物，序列分别为SEQNO.1、SEQNO.2，以所述方法获得的DNA作为模板，每个反应作3个重复，反应体系为表1；表1.荧光定量反应体系反应条件为：94℃，30s；94℃5s，56℃20s，72℃20s，44个循环；(2)结果判定：PCR反应结束后，比较收集得到的荧光曲线不掺有棕榈油样品中DXS基因未见扩增，其动力学曲线近似直线，掺杂有棕榈油样品DXS基因扩增的动力学曲线出现单峰，有可见特异性扩增。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术所提供的高效提取鱼油(或鱼油与棕榈油混合样品)DNA的方法，主要为了后续基于核酸水平上的检验。本专利技术中对油脂进行反复、充分乳化，使水油分散均匀，形成稳定的乳浊液，利于裂解剂充分裂解细胞，释放DNA。采用平衡酚与氯仿-异戊醇混合液分步抽提，而非沿用传统方法中平衡酚：氯仿：异戊醇同步抽提，主要是因为分步抽提可充分去除油脂中的多糖、蛋白质以及其他污染物，尤其苯酚可与蛋白质表面的极性集团结合，蛋白分子可充分溶解于酚相。否则，DNA的纯度不够好，将进一步影响后续荧光定量RT-PCR等实验的进行。在DNA沉淀步骤中使用了核酸纯化吸附柱，可获得更高纯度的DNA。基于获得的高质量DNA，本专利技术进一步针对棕榈油的特征基因DXS的特异区设计一对特异性检测棕榈油的引物，并优化反应体系和反应程序，建立了实时荧光定量RT-PCR鉴定鱼油中掺杂棕榈油的方法。测试结果表明，该方法具有较强的特异性与灵敏性，0.01％浓度的棕榈油掺入鱼油中亦可特异性检出。该方法的灵敏性远胜于薄层色谱技术、光谱法、电导法以及质谱技术等各类化学方法。同时大大缩短了检测时间，降低了检测成本，具有无可比拟的优点，适宜大范围推广应用。附图说明图1是以本专利技术实施例1提取的鱼油、棕榈油及二者不同比例混合样品的DNA。其中，1为鱼油，2为棕榈油，3～7均为棕榈油：鱼油混合样品，分别是0.01％、0.05％、1％、5％、10％。图2是以本专利技术实施例1提取的鱼油、棕榈油及二者不同比例混合样品的DNA为模板，扩增16SrRNA基因片段，所获产物的琼脂糖电泳图，其中M为DNA分子量标准(DL2000，上海生工)，1是鱼油样品的DNA，2是棕榈油样品的DNA，3～7分别是0.01％、0.05％、1％、5％、10％棕榈油：鱼油比例的样品DNA。图3是荧光定量RT-PCR熔解曲线，其中1号直线是以鱼油样品DNA为模板，DXS基因特异引物进行荧光定量RT-PCR扩增所展现的动力学曲线；2是棕榈油样品的DNA，3～7分别是0.01％、0.05％、1％、5％、10％棕榈油：鱼油比例的样品DNA所展现出单峰的曲线，所述单峰的曲线是DXS基因特异引物进行荧光定量RT-PCR扩增所展现的动力学曲线。具体实施方式下面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)水相制备：取鱼油样品、无菌ddH2o置于灭菌烧杯中，鱼油样品与无菌ddH2o的体积比为10：1，充分混匀后置于磁力搅拌器中搅拌1h，4℃条件下12000rpm离心2min，弃上层油脂，向下层水相再次加入相同体积的鱼油，重复上述操作3次，保存水相；(2)裂解消化：取2ml步骤(1)中的水相至离心管，加入等体积预热至65℃的CTAB裂解液与蛋白酶K，涡旋混匀，65℃温育30min，得样品裂解液；(3)分步抽提：对步骤(2)中的样品裂解液先使用等体积平衡酚进行抽提1次，对上清液再进一步使用等体积氯仿：异戊醇混合液抽提2次，所述混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24：1，得上清液，放置5min，然后4℃条件下12000rpm离心10min；(4)沉淀DNA：取步骤(3)中的上清液，加入0.8倍体积的‑20℃预冷的异戊醇和0.1倍体积的3mol/l NH4Ac，颠倒混匀后全部转移至核酸纯化吸附柱，收集液于‑20℃静置30min后再次转入核酸纯化吸附柱，取出吸附柱，弃去收集管内液体，用1ml体积分数为75％的乙醇溶液冲洗吸附柱，室温下静置5min，使乙醇充分挥发；随后将吸附柱取出放入新的离心管，向吸附柱中加入50μl TE溶液，静置3min，4℃条件下12000rpm离心1min，DNA溶液即被收集在离心管中。...

【技术特征摘要】
1.一种鱼油及其与棕榈油混合物的DNA提取方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)水相制备：取鱼油样品、无菌ddH2o置于灭菌烧杯中，鱼油样品与无菌ddH2o的体积比为10：1，充分混匀后置于磁力搅拌器中搅拌1h，4℃条件下12000rpm离心2min，弃上层油脂，向下层水相再次加入相同体积的鱼油，重复上述操作3次，保存水相；(2)裂解消化：取2ml步骤(1)中的水相至离心管，加入等体积预热至65℃的CTAB裂解液与蛋白酶K，涡旋混匀，65℃温育30min，得样品裂解液；(3)分步抽提：对步骤(2)中的样品裂解液先使用等体积平衡酚进行抽提1次，对上清液再进一步使用等体积氯仿：异戊醇混合液抽提2次，所述混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24：1，得上清液，放置5min，然后4℃条件下12000rpm离心10min；(4)沉淀DNA：取步骤(3)中的上清液，加入0.8倍体积的-20℃预冷的异戊醇和0.1倍体积的3mol/lNH4Ac，颠倒混匀后全部转移至核酸纯化吸附柱，收集液于-20℃静置3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李风铃，王印庚，姚琳，江艳华，钟友欢，翟毓秀，尚德荣，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37