一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法。本发明专利技术的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺。本发明专利技术的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗采用自诱导分泌表达的去毒产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白制备，该疫苗具有安全、免疫效力好、工艺简单、成本低等优点，能有效避免现有技术疫苗的生产工艺较复杂、成本较高等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
产气荚膜梭菌(ClostridiumPerfringens)也称魏氏梭菌，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一。该菌的致病因子是其分泌的外毒素，主要是α、β、ε和ι毒素，据此将该菌分为A、B、C、D、E等5个毒素型，ε毒素为B型和D型产气荚膜梭菌产生。产气荚膜梭菌可导致山羊、绵羊等动物的致死性肠道疾病，对畜牧业造成很大的经济损失。产气荚膜梭菌病发病急、病程短、死亡率高，免疫疫苗是本病的主要治疗手段，目前使用的商品化灭活疫苗，是将培养的产气荚膜梭菌菌液或外毒素灭活制备而成，存在稳定性差、副反应大以及灭活不彻底的安全隐患。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素，它是产气荚膜梭菌主要的毒力因子，其中A型产气荚膜梭菌分泌α毒素最多。α毒素基因位于染色体上，大小为1194bp，编码的产物由398个氨基酸残基组成，其中前28个氨基酸为信号肽，成熟肽为370个氨基酸。α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性，能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂，导致细胞裂解，因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。因此，研究者利用基因工程技术将毒素去毒性，作为抗原研制疫苗。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程。相比之下，如果外源蛋白能以“胞外分泌”的形式表达，即目的蛋白分泌至细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，获得具有生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难；而且杂蛋白少，目的蛋白的回收相对简单。美国Brookhaven实验室的Studier提出了外源基因表达自诱导(Auto-induction)的方法。即大肠杆菌首先以葡萄糖为碳源生长至饱和状态，待葡萄糖消耗殆尽，达到一定活力后，开始利用培养基中的乳糖。其主要机理是在lacY与lacZ的基因产物乳糖渗透酶(1actosepermease)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启了T7表达系统，此时乳糖的代谢产物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖)也可作为细菌生长的碳源。与传统IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)相比，乳糖无细胞毒性、价格较低，自诱导在培养基中含有诱导剂，无需在培养过程中检测重组菌的生长情况添加诱导剂。目前，已有关于产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的报道，如牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用(申请号CN201710819084.5)、抑制产气荚膜梭菌感染的重组α蛋白及其制备方法与应用(申请号CN201610304595.9)、一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用(申请号CN201410117383.0)。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组菌的生长情况添加诱导剂；α毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的过程。本专利技术制备的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，采用自诱导分泌表达的去毒产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白制备，该疫苗具有安全、免疫效力好、工艺简单、成本低等优点，能有效避免现有技术疫苗的生产工艺较复杂、成本较高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于制备产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，用于预防由A型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。为此，本专利技术提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个突变。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与成熟的野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生定点突变。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与成熟的野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个定点突变。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位发生突变。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为组氨酸之外的氨基酸。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为选自以下氨基酸组成的组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白不具备α毒素蛋白的磷脂酶C活性。另一方面，本专利技术提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白通过自诱导体系表达。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白通过大肠杆菌自诱导体系表达。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白通过大肠杆菌BL21自诱导体系表达。在一些实施方式中，其特征在于，所述大肠杆菌BL21的培养基包括自诱导培养基和消泡剂。在一些实施方式中，其特征在于，所述大肠杆菌BL21的培养基包括自诱导培养基和0.01～0.02％消泡剂。在一些实施方式中，其特征在于，所述大肠杆菌BL21的培养基包括发酵罐容积60～70％的自诱导培养基和0.01～0.02％消泡剂。在一些实施方式中，其特征在于，大肠杆菌BL21的发酵培养参数设置为：温度28℃，pH值7.0，通气量15升/分钟，28℃培养20～24小时。在一些实施方式中，其特征在于，产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素相比，其氨基酸序列发生了定点突变。在一些实施方式中，其特征在于，所述定点突变引物根据将产气荚膜梭菌α毒素蛋白的第176位氨基酸进行突变而设计。在一些实施方式中，其特征在于，所述定点突变引物根据将产气荚膜梭菌α毒素蛋白的第176位氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺而设计。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白在制成疫苗前进行无菌检验。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与佐剂混匀制备所述产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因工程疫苗。在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与氢氧化铝胶佐剂混匀制备所述产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因工程疫苗。在一些实施方式中，其特征在于，对所述产气荚膜梭菌α毒素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个突变。

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个突变。2.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个定点突变。3.根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位发生突变。4.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为选自以下氨基酸组成的组中：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。5.根据权利要求4所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺。6.一种分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株的构建方法，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：1）根据GeneBank上公布的α毒素基因序列AY823400.1设计引物，以A型产气荚膜梭菌DNA为模板，进行PCR扩增；2）PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏后军，王芳，范志宇，胡波，宋艳华，薛家宾，仇汝龙，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32