BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物及其筛选方法，将坏死通路敏感细胞系L929‑FADD基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死的模式细胞，从FDA药物库中筛选影响抑制细胞死亡的小分子化合物，再对筛选得到的小分子化合物进行不同药物浓度的检测，明确毒性‑效应浓度，从毒性和恢复效率综合评估，获得BRAF抑制剂通过抑制细胞发生坏死实现其用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物。BRAF抑制剂在坏死敏感细胞系L929‑FADD敲除株、人细胞系HT29和动物模型上均有极好的抑制坏死效果，其水溶性比Nec‑1好，是FDA已获批的临床药物，靶向性和安全性有保障，易于临床推广。

BRAF inhibitors for the preparation and screening of new drugs for the treatment of programmed necrosis

The invention discloses BRAF inhibitors for preparing novel drugs for treating programmed necrosis diseases and their screening methods. The necrosis pathway sensitive cell line L929 FADD gene knockout cell line is used as a model cell for cell proliferation and necrosis, small molecule compounds affecting cell death are screened from the FDA drug bank, and the selected small molecule compounds are subjected to different drug concentrations. To determine the concentration of toxicity and effect, and to synthetically evaluate the toxicity and recovery efficiency, BRAF inhibitors can be used to prepare new drugs for the treatment of programmed necrosis diseases by inhibiting cell necrosis. BRAF inhibitors have excellent anti-necrosis effects on necrosis-sensitive cell line L929 FADD knockout, human cell line HT29 and animal models. Their water solubility is better than Nec 1. BRAF inhibitors are approved by FDA as clinical drugs. They have good targeting and safety and are easy to be popularized in clinic.

【技术实现步骤摘要】
BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物及其筛选方法
本专利技术涉及细胞学药理学领域，具体地说，涉及BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物，还涉及用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂的筛选方法。
技术介绍
细胞有序增殖、分化和死亡之间的动态平衡是维持内环境稳态的首要条件，程序性坏死是一种重要的细胞死亡方式，与凋亡不同，其不依赖caspase蛋白酶的死亡方式，而是通过RIP3和RIP1的蛋白激酶，其相互作用及磷酸化影响程序性坏死。细胞坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应等。目前，研究证据表明程序性坏死参与了诸多临床难题，最典型的为病原体感染如病毒感染引起的急性重型肝细胞坏死，炎症性疾病如急性胰腺炎、缺血性伤害、神经退化等。坏死细胞凋亡是基于细胞坏死的可调控性渐渐为人研究的新现象，该现象发生在广谱caspase抑制剂Z-VAD存在的条件下，TNFR1与其相应的天然配体结合后发生的具有坏死样形态特征和自噬活化作用的程序性细胞死亡。美国袁筠英教授及其同事通过对大约15000种化合物的筛选，找到一种称作程序性坏死抑制剂necrostatin-1(Nec-1)的小分子化合物，能阻断坏死样细胞凋亡发生的关键步骤，而特异性地抑制坏死样细胞凋亡。继Nec-1之后，科学家又陆续报道Nec-1家族的同分异构体Nec-3、Nec-5和Nec-7，并且证实了它们阻断程序性坏死的作用。有报道Nec-1的细胞靶点是受体相互作用蛋白1激酶(receptor-interactingprotein1kinase，RIP-1)，RIP-l是细胞死亡通路的开关，与细胞坏死、细胞凋亡及自吞噬死亡均有密切关系，以Nec-l为代表的necrostatin家族是研究程序性坏死的机制及其引发疾病的重要工具。除Nec-1之外，没有合适的工具进行坏死潜在机制的研究，同时坏死性疾病的靶向药物也存在缺失，亟需开发新型药物。目前，研究和开发创新药物的基础是选择适当的筛选模型筛选样品，发现作用优良并具有特点的药物。开展高通量药物筛选，是发现创新药物的重要技术手段之一，采用适当药物作用靶点对大量化合物样品进行筛选，而且筛选规模越大，发现新药的机会越多。基于细胞模型的筛选，特别适用于功能蛋白难以分离、生化分析不能完成的复杂靶标(这些靶标可能涉及受体或细胞因子间复杂的相互作用)或多靶标。根据作用形式的不同，细胞模型可以分为作用于靶标(位于单一细胞位置，细胞膜上或细胞内)的筛选和作用于细胞整体功能、活性的筛选；其中前者作用位点和机制清楚，但必须明确靶标的生理功能及相应检测方法，后者能直接反映药物对细胞的整体反应，包括细胞毒性、细胞增殖特性，生长和死亡情况等。传统的基于天然产物或小分子化合物库筛选药物主要存在两大缺陷，一是在新药和治疗性生物制品的开发创新方面研发时间长，投资风险大；二是筛选出的药物溶解性和安全性亟需动物及临床验证。同时，对于靶向坏死抑制剂的药物筛选及应用，目前主要存在以下几个不足之处，包括：(1)以Nec-1为代表的necrostatin家族是一种小分子化合物，虽然容易穿过血脑屏障，是良好的分子机制研究工具，但因其化合物家族难溶于水或者电解质溶液，难以作为临床药物进行新药研发工作；(2)Nec-1不是食药监局批准的上市药物，其体内的安全性、细胞毒性和组织毒性缺乏数据支撑，不利于后期临床新药的评估应用；(3)已有新药筛选平台大多是基于未知天然产物或化合物的筛选，其投入成本高，筛选周期和验证实验所需时间长；(4)基于未知化合物筛选出的药物，其对于人体的靶向性不明确，缺乏细胞毒性、细胞代谢和药物毒理学、药物动力学的数据；(5)目前已有的筛选平台基于普通细胞系或动物，筛选平台所用的模式细胞不利于判断药物对于程序性坏死的敏感度测试。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物，还提供上述用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂的筛选方法，基于FDA批准的药物库，选择坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死的模式细胞，从FDA药物库的小分子化合物(1068种)中筛选影响抑制细胞死亡的小分子化合物，并进行不同药物浓度的相关性检测，明确其毒性-效应浓度，基于对毒性和恢复效率的综合考量，获得通过抑制细胞发生坏死来实现其制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：第一方面，BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物。进一步地，上述BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物，通过抑制细胞发生坏死来实现。更进一步地，上述BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物，通过靶向抑制细胞发生坏死来实现。第二方面，上述用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂的筛选方法，选择坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死的模式细胞，从FDA药物库的若干小分子化合物中筛选影响抑制细胞死亡的小分子化合物，再对筛选所得小分子化合物进行不同药物浓度的检测，明确其毒性-效应浓度，并从毒性和恢复效率综合评估，获得通过抑制细胞发生坏死实现其作为制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂；具体地，包括以下步骤：(1)所述坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株复苏、培养与冻存，和(2)所述药物库的若干小分子化合物定量，且以Nec-1作为阳性对照，和(3)构建用于制备治疗程序性坏死疾病药物的小分子化合物筛选的细胞模型，和(4)检测步骤(3)中所述细胞模型的细胞存活率，并筛选小分子化合物，和(5)蛋白免疫沉淀检验验证步骤(4)中所述小分子化合物在坏死信号通路上的表达。进一步地，步骤(1)的具体方法为：于液氮中取出冻存的L929细胞和L929-FADD-KO细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动细胞快速融解，然后将所述的L929细胞和L929-FADD-KO细胞分别转入培养皿中加入培养基进行培养过夜，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代；其中，所述L929细胞的培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基，于5％CO2、37℃和饱和湿度条件下培养；所述L929-FADD-KO细胞的培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基且加入0.05μL/mLpruo和0.33μL/mLNec-1，于5％CO2、37℃和饱和湿度条件下培养；再选生长状态好、生长旺盛的细胞用PBS洗两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用RPMI-1640培养基终止反应，800rpf离心5分钟后弃上清，加入冻存液，将细胞分装于冻存管中，放入程序降温盒中保存于-80℃超低温冰箱中，24小时后转移至液氮中；其中，所述RPMI-1640培养基内含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素，终止反应条件为：95％空气、5％二氧化碳、37℃；所述冻存液的成分为：10％DMSO和90％小牛血清。进一步地，步骤(2)中小分子化合物定量为：每管100μL，浓度为10mM，使用浓度为30μM，且以使用浓度为30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物。

【技术特征摘要】
1.BRAF抑制剂用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述BRAF抑制剂通过抑制细胞发生坏死来实现。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述BRAF抑制剂靶向抑制细胞发生坏死。4.根据权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于，所述BRAF抑制剂为药物活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。5.权利要求1～4任一项所述用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物BRAF抑制剂的筛选方法，其特征在于，将坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株作为细胞增殖和坏死的模式细胞，从FDA药物库若干小分子化合物中筛选影响抑制细胞死亡的小分子化合物，再对筛选所得的小分子化合物进行不同药物浓度的检测，明确其毒性-效应浓度，并从毒性和恢复效率综合评估得到BRAF抑制剂，其通过抑制细胞发生坏死用于制备治疗程序性坏死疾病的新型药物；所述BRAF抑制剂的筛选方法包括以下步骤：(1)所述坏死通路敏感细胞系L929-FADD基因敲除细胞株复苏、培养与冻存，和(2)所述FDA药物库的若干小分子化合物定量，且以Nec-1作为阳性对照，和(3)构建用于制备治疗程序性坏死疾病药物的小分子化合物筛选的细胞模型，和(4)检测步骤(3)中所述细胞模型的细胞存活率，并筛选所述小分子化合物，和(5)蛋白免疫沉淀检验验证步骤(4)中所述小分子化合物在坏死信号通路上的表达。6.根据权利要求5所述BRAF抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：于液氮中取出冻存的L929细胞和L929-FADD-KO细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动细胞快速融解，然后将所述的L929细胞和L929-FADD-KO细胞分别转入培养皿中加入培养基进行培养过夜，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代；其中，所述L929细胞的培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基，于5％CO2、37℃和饱和湿度条件下培养；所述L929-FADD-KO细胞的培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基且加入0.05μL/mLpruo和0.33μL/mLNec-1，于5％CO2、37℃和饱和湿度条件下培养；再选生长状态好、生长旺盛的细胞用PBS洗两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用RPMI-1640培养基终止反应，800rpf离心5分钟后弃上清，加入冻存液，将细胞分装于冻存管中，放入程序降温盒中保存于-80℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，巴乾，牟为，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：上海,31