一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法与应用。该增变菌株通过编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ被敲除、插入失活或突变而丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。本发明专利技术通过利用λ‑Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基具的基因dnaQ进行敲除，获得了DNA复制过程中校正功能丧失的增变菌株，该菌株的突变能力为野生型的25000倍，是高效的基因诱变手段。同时减少筛选优良性状的工作时间成本，提高科研工作和工程菌选育的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用
本专利技术属于生物技术工程领域，具体涉及通过大肠杆菌danQ基因被敲除、插入失活或因突变而丧失其校正功能，导致DNA复制的突变率增大的基因增变菌株；以及将该增变菌株应用于诱变目标基因以达到筛选优良性状的目的和该菌直接用于选育具有特定性状的突变体。
技术介绍
微生物菌种在自然条件下发生突变的频率较低，且突变幅度不大，基因结构一般很难发生改变，因此在生产和研究中为了获得具有特定性状的菌株，往往需要对微生物进行诱变育种。微生物诱变育种是指在人为条件下利用物理、化学或生物等因素，诱发微生物体产生突变，通过筛选，培育微生物新菌株的方法。最常见的诱变方法为物理诱变、化学诱变和生物诱变。随着生命科学发展以及学科交叉的深入，诱变育种技术得到不断发展和创新，从而为筛选更多高效菌种提供了技术上的可行性和便利。DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌染色体DNA复制的主要酶，它由α、β、γ、δ、ε等亚基组成，其中α亚基具有5'→3'的DNA聚合酶活性，ε亚基具有3'外切酶活性，负责DNA复制过程中的校对功能，可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性。DNA聚合酶III的ε亚基由dnaQ基因编码。现有技术还没有将dnaQ基因突变的菌株用作增变菌株进行生物诱变。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基因增变菌株，通过大肠杆菌dnaQ基因被敲除、插入失活或因突变而丧失其校正功能，导致DNA复制的突变率增大，因此dnaQ基因突变的菌株可以用作增变菌株进行生物诱变，提高基因突变的频率，减少筛选优良性状的工作时间成本。为了实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：第一方面，提供一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株，该菌株是通过编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ被敲除、插入失活或突变而丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。优选地，上述基因增变菌株是通过利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ进行敲除，使之丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。进一步地，上述λ-Red重组酶方法构建大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株的方法，包括以下步骤：(1)设计引物：用于同源重组的引物为dnaQtetR和dnaQtetA；设计原则是5'端为dnaQ基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为EdnaQU及EdnaQD，这些引物的序列如下所示：dnaQtetR：ACACGCCAGATCGTTCTCGATACCGAAACCACCGGTATGATTAAGACCCACTTTCACAT(SEQIDNO:1)；dnaQtetA：TTATGCTCGCCAGAGGCAACTTCCGCCTTTCTTCTGCACCCTAAGCACTTGTCTCCTG(SEQIDNO:2)；EdnaQU：CTACCTGTTTAAGCATCTC(SEQIDNO:3)；EdnaQD：GTCAACGGTTTTTCTCATC(SEQIDNO:4)；(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac(Tet+，Kan+，购自武汉淼灵生物科技有限公司)的DNA为模板，dnaQtetR及dnaQtetA为引物进行PCR扩增，获得两端分别与dnaQ基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化。(3)感受态细胞的制备：将含有pKD46质粒的DH5α菌株在含有20μg/mLAmp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mLAmp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2300V电击，电击后迅速加入800μLLB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用EdnaQU和EdnaQD引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株。获得大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株，还可以通过部分敲除dnaQ基因或在dnaQ基因中插入外源DNA片段来实现。部分敲除dnaQ基因引物设计原则是先确定要敲除的序列，引物的5'端为待敲除序列相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列；插入外源DNA序列使dnaQ基因失活的引物设计原则是先确定插入外源DNA的位置，引物的5'端为待插入位置相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列。用来敲除、替换或插入的基因片段，除了可以选用四环素抗性基因tetRA的DNA片段外，还可以选择其它抗性基因片段，如氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、甲氧西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等抗性基因；或者其它便于筛选的标记基因如绿色/红色荧光蛋白基因等。第二方面，提供上述大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株在基因诱变筛选中的应用，具体为将外源DNA导入所述增变菌株的感受态细胞中进行诱变。第三方面，提供上述大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株在选育具有特定性状的突变体中的应用，具体为直接以所述增变菌株为选育对象，对其因基因突变而产生的具有特定性状的突变体进行选育。本专利技术相对于现有技术的优势在于：1、本专利技术通过利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基具的基因dnaQ进行敲除，获得了DNA复制过程中校正功能丧失的增变菌株，在培养过程中自身的基因就会不断的发生基因突变，该菌株的突变能力为野生型的25000倍，出现一些新的性状，可直接用于选育具有特定性状的突变体。2、本专利技术的增变菌株可以提高基因突变的频率，该菌由于丧失了修复功能，将外源的DNA导入该菌中进行突变，是高效的基因诱变手段。减少筛选优良性状的工作时间成本，提高科研工作和工程菌选育的效率。附图说明图1PCR产物切胶回收电泳检测；M：DL5000DNA标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。图2菌落PCR鉴定图；M：DL5000DNA标样；1：对照；2-5：实验组。图3A潜在的tsr突变体(T)的筛选；图3B野生型tsr(pjc3)及tsr突变体tsr-M309I和tsr-E436K在甲基修饰系统缺失菌株uu2610中的功能。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。【实施例1】利用λ-Red重组酶方法对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ进行敲除(1)设计引物：用于同源重组的引物为dnaQtetR和dnaQtetA；设计原则是5'端为dnaQ基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株，其特征在于，该菌株是通过将编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ敲除、插入失活或突变任意一种方式而丧失其在DNA复制过程中校正功能而获得的。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株，其特征在于，该菌株是通过将编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ敲除、插入失活或突变任意一种方式而丧失其在DNA复制过程中校正功能而获得的。2.根据权利要求1所述的基因增变菌株，其特征在于，所述的将编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ敲除是利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ进行敲除，使之丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。3.根据权利要求2所述的基因增变菌株，其特征在于，所述的λ-Red重组酶方法构建大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株的方法，包括以下步骤：(1)设计引物：用于同源重组的引物为dnaQtetR和dnaQtetA；设计原则是5'端未加下划线的核苷酸为dnaQ基因的同源区，3'端加下划线的核苷酸为四环素抗性基因tetRA的同源序列，重组体的检测所用引物为EdnaQU及EdnaQD，这些引物的序列如下所示：dnaQtetR：ACACGCCAGATCGTTCTCGATACCGAAACCACCGGTATGATTAAGACCCACTTTCACAT(SEQIDNO:1)；dnaQtetA：TTATGCTCGCCAGAGGCAACTTCCGCCTTTCTTCTGCACCCTAAGCACTTGTCTCCTG(SEQIDNO:2)；EdnaQU：CTACCTGTTTAAGCATCTC(SEQIDNO:3)；EdnaQD：GTCAACGGTTTTTCTCATC(SEQIDNO:4)；(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac(Tet+，Kan+，购自...

【专利技术属性】
技术研发人员：王松太，郭书奎，周鑫鑫，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42