一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度的靶基因、引物对、试剂盒和检测方法技术

本发本发明专利技术属于农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度的靶基因、引物对、试剂盒和检测方法。一种用于对虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测的靶基因；该靶基因的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还提供了一种用于检测上述的序列如SEQ ID NO:1所示靶基因的引物对。本发明专利技术还提供了一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度检测方法，该方法包括步骤：1）从待检对虾中提取总DNA；2）以步骤1）所得DNA为模板采用所述的引物对进行PCR扩增；3）用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测步骤2）所得PCR产物，如产生目标条带，则证明该对虾感染了肝肠微胞子虫。本发明专利技术基于EHP的一种孢壁蛋白基因（SWP）设计引物，该引物的特异性强，与病原EHP之间存在明确的对应关系，适合用作PCR方法进行对虾肝肠微孢子虫的检测引物。

A highly sensitive target gene, primer pair, kit and detection method for hepatointestinal microsporidiasis in shrimp

The invention belongs to the technical field of agriculture and animal quarantine, and specifically relates to a highly sensitive target gene, primer pair, kit and detection method for hepatointestinal microsporidiasis of shrimp. A target gene for high sensitivity detection of hepatointestinal microsporidiasis in shrimp is presented, and the sequence of the target gene is shown in SEQ ID NO:1. The present invention also provides a pair of primers for detecting the target gene as shown in SEQ ID NO:1. The invention also provides a highly sensitive detection method for shrimp liver and intestinal microspore worm. The method comprises the following steps: 1) extracting total DNA from the shrimp to be examined; 2) taking the DNA obtained from step shrimp 1 as the template, using the primer pair to amplify the PCR; and 3) using the 1.5% agarose gel electrophoretic detection step 2) the PCR product, such as the target strip, proves that the shrimp is infected with the liver and intestine. Microcystis. The invention designs a primer based on a spore wall protein gene (SWP) of EHP. The primer has strong specificity and has a clear correspondence with pathogenic EHP. It is suitable for the detection of microsporidia in shrimp liver and intestine by PCR method.

【技术实现步骤摘要】
一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度的靶基因、引物对、试剂盒和检测方法
本专利技术属于农业和动物检疫
，具体涉及一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度的靶基因、引物对、试剂盒和检测方法。
技术介绍
微孢子虫（microsporidia）是一种单细胞的真核内寄生虫，广泛寄生于虾、甲壳类等动物。对虾肝肠微孢子虫（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）是微孢子虫的一种，属于微孢子虫科、肠胞虫属，最早于2009年在泰国养殖的斑节对虾（Penaeusmonodon）中发现，随后在亚洲各国的凡纳滨对虾、脊尾白虾和中国对虾养殖区陆续有EHP检出。研究表明EHP的感染途径较广，可通过污染的养殖水体和病虾进行水平传播，也可以通过受精卵和虾苗进行垂直传播。EHP感染的对虾初期没有明显症状，但随着病程的发展体色、胃、肠均明显异常，体色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别虾体还会出现白便症状。由于该病在早前难以发现，往往要养殖30-45天以上才会表现出生长缓慢，不长个的现象，因此极易造成饲料空耗，给养殖户带来较大的经济损失。近几年，EHP在全世界范围内传播，亚洲的中国、马来西亚、越南、印度尼西亚、泰国已经成为了重灾区，印度和墨西哥也有发现，极大地打击了虾农的生产积极性。PCR技术具有高特异性、高灵敏度的特性，被广泛应用于各位病原生物的检测。关于对虾肝肠微孢子虫的分子检测方法已有一定数量报道，且主要集中在以一个核糖体小亚基作为PCR的目标基因。有学者设计特异性引物EHP-510F和EHP-510R来检测EHP的存在（DevelopmentofinsituhybridizationandPCRassaysforthedetectionofEnterocytozoonhepatopenaei(EHP),amicrosporidianparasiteinfectingpenaeidshrimp[J],JournalofInvertebratePathology,2015,130:37-41）。但用该方法中扩增的510bp片段经NCBI检索，发现与其他物种的核糖体序列具有较高的同源性，特别是引物区高度同源（图1，图2，图3），因此用此引物扩增所得的目的片段有可能会来源于其他的微孢子虫，而并非是引起对虾肝肠微孢子虫病的病原。Ding等针对了相同的核糖体小亚基序列，设计V1F和964R引物对来检测EHP的感染情况（Anewmicrosporidium,Potasporamacrobrachiumn.sp.infectingthemusculatureofpond-rearedorientalriverprawnMacrobrachiumnipponense(Decapoda:Palaemonidae)[J],JournalofInvertebratePathology,2016,136:57-64.）。但是我们的检测结果显示，该引物对于感染EHP的对虾样品检测效果并不理想（图5）。广州双螺旋基因技术有限公司申请了专利“一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒”（申请号201710917654.4），设计了EHP-OF/OB、EHP-IF/IB、EHP-LF/LB三对引物组合，用恒温扩增方法（LAMP）进行EHP检测。同样地，用该方法扩增的157bp核糖体基因片段也存在与其他物种高度同源的现象（图3，图4）。上述PCR引物对均是基于EHP的一个核糖体小基因所设计，不同种属微孢子虫的核糖体基因的碱基序列存在高度保守性。目前研究表明，引起虾体生长缓慢，饲料空耗现象的微孢子虫是肝肠微孢子虫（Enterocytozoonhepatopenaei），而非其他种属的微孢子虫，因此选择该核糖体基因作为EHP病原检测的靶基因并非十分理想，容易造成非特异性扩增，从而提升假阳性率。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于对虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测的靶基因；该靶基因的序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测上述的序列如SEQIDNO:1所示靶基因的引物对；优选，本专利技术的所述的引物对，其序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。本专利技术的第三个目的是提供一种试剂盒，包含上述的引物对的用于对虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测。本专利技术的第四个目的是提供所述的引物对扩增的PCR产物；其序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术的第五个目的是提供上述的靶基因、引物对、试剂盒或PCR产物用于制备虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测产品中的应用。本专利技术的第六个目的是提供所述的一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度检测方法，该方法包括步骤：1）从待检对虾中提取总DNA；2）以步骤1）所得DNA为模板采用权利要求2或3所述的引物对进行PCR扩增；3）用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测步骤2）所得PCR产物，如产生目标条带，则证明该对虾感染了肝肠微胞子虫。优选，所述的步骤1）提取总DNA的方法如下：1）取50-100mg的对虾组织，带肠道组织，于2mL的离心管中；2）加入200uLGA和磁珠1颗，研磨30s；3）加入20uL蛋白酶K，浓度为100mg/mL，56℃孵育3h；4）加入200uLGB，70℃孵育10min；5）加入200uL无水乙醇，混匀后加入离心柱；6）经一次GD，两次WP洗涤后，晾干5-10分钟；7）加入100uLTE，离心得到的为对虾DNA，-20℃保存备用。优选，所述的步骤2）采用序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物对进行PCR扩增，步骤3）PCR产物条带的位置为568bp处，如有目的片段，即可判定该样品为EHP阳性。优选，步骤2）所述的PCR反应体系为：PCR模板DNA5.0μL、2×PCRMixture10.0μL、10mM的正向引物0.5μL、10mM的反向引物0.5μL、ddH2O：4.0μL，PCR反应体系体积为20μL；所述的PCR扩增的程序为：1）于94℃进行模板DNA的预变性反应，反应时间为5min；2）于94℃进行模板DNA的变性反应，反应时间为30s；3）于55℃进行退火，时间为30s；4）于72℃下进行延伸，时间为45s；5）循环步骤1）～4）40次；6）于72℃延伸5min。本专利技术由于采用了上述的技术方案，基于EHP的一种孢壁蛋白基因（SWP）设计引物，该引物的特异性强，与病原EHP之间存在明确的对应关系，适合用作PCR方法进行对虾肝肠微孢子虫的检测引物。附图说明图1：以EHP-510F和EHP-510R为引物，将扩增得到的基因序列在NCBI数据库中检索，得到的同源序列列表。结果显示与其他种属微孢子虫的核糖体小亚基序列同源性超过99%。图2：在同源比对结果列表中，选取其中的一条序列比对序列，结果显示引物区的匹配度为100%。图3：以LAMP方法扩增得到的基因序列在NCBI数据库中检索，得到的同源序列列表。结果显示与一种微孢子虫（enterosporanucleophila）的核糖体小亚基序列同源性100%。图4：基因序列比对结果显示，引物区的匹配度为100%。图5：本专利技术所设计的引物与其他引物的效果差异比较1泳道：1号阳性样品用本专利技术引物的扩增条带2泳道：2号阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测的靶基因，该靶基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于对虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测的靶基因，该靶基因的序列如SEQIDNO:1所示。2.一种用于检测权利要求1所述的靶基因的引物对。3.根据权利要求2所述的引物对，其序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。4.一种包含权利要求2或3所述引物对的试剂盒。5.一种权利要求3所述的引物对扩增的PCR产物，其序列如SEQIDNO:4所示。6.根据权利要求1~4任意一项权利要求所述的靶基因、引物对、试剂盒或PCR产物用于制备虾肝肠微孢子虫病高灵敏度检测产品中的应用。7.一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度检测方法，其特征在于，该方法包括步骤：1）从待检对虾中提取总DNA；2）以步骤1）所得DNA为模板采用权利要求2或3所述的引物对进行PCR扩增；3）用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测步骤2）所得PCR产物，如产生目标条带，则证明该对虾感染了肝肠微胞子虫。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤1）提取总DNA的方法如下：1）取50-100mg的对虾组织，带肠道组织，于2mL的离心管中；2）加入200uLGA和磁珠1颗，研磨30s；3）加入20uL...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈卫锋，牛宝龙，翁宏飚，杨颖，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33