本发明专利技术公开了一种鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的引物及方法，包括上游引物（如SEQ ID NO：1所示）和下游引物（如SEQ ID NO：2所示）。根据基因多态性区域特征，设计特定的引物，经PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段，通过测序、分析，能够对PvMSP‑3α基因是否突变进行鉴定，进而区分出是野生型还是突变型。此外，本发明专利技术还公开了该鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的特异性引物在制备鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的检测工具中的应用。
Primers, methods and applications for identification of PvMSP-3alpha gene polymorphism of Plasmodium vivax
The invention discloses a primer and a method for identifying PvMSP_3alpha gene polymorphism of Plasmodium vivax, including upstream primers (as shown in SEQ ID NO:1) and downstream primers (as shown in SEQ ID NO:2). According to the regional characteristics of gene polymorphism, specific primers were designed, and DNA fragments containing conservative and polymorphic regions were amplified by PCR. Through sequencing and analysis, the mutation of PvMSP_3a gene could be identified, and then the wild type or mutant type could be distinguished. In addition, the invention also discloses the application of the specific primer for identifying the PvMSP_3alpha gene polymorphism of Plasmodium vivax in the preparation of a detection tool for identifying the PvMSP_3alpha gene polymorphism of Plasmodium vivax.
【技术实现步骤摘要】
鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物、方法及应用
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物及方法。
技术介绍
疟疾是一种严重危害人类健康、影响社会经济发展的重要寄生虫病，根据世界卫生组织（WHO）统计，2016年全球有91个国家和地区流行疟疾，病例数为2.16亿，比2015年增加500万，死亡数为44.5万。2016年，我国共报告疟疾病例3321例。在世界各国政府和国际组织的努力下，自2000年至2016年，疟疾发病人数减少18%，致死人数下降了47%。然而，近年来在东南亚的缅甸、老挝、柬埔寨、泰国和越南分别出现了疟原虫对青蒿素产生耐药性的报导，表现为患者经青蒿素治疗后疟原虫被延迟清除。虽然目前暂时没有证据显示发生在东南亚地区的青蒿素耐药性波及中国，但曾经有效的疟疾防治措施面临严峻挑战。尽管针对疟疾疫苗的研究工作已经开展几十年，但至今仍未能研制出能够用于现场对抗疟疾感染有效的疫苗。疟原虫生活史复杂，人体内发育包括红内期和红外期，红内期是指裂殖子入侵后在红细胞内形成环状体，经发育繁殖形成裂殖体，并引起人体致病乃至致命。由于疟原虫红内期是疟疾致病的主要阶段，红内期疫苗既可预防疟原虫感染，也可用于疟疾感染病人的治疗。因此，疟原虫红内期疫苗候选分子的筛选和鉴定得到了国内外科学家的格外重视。疟疾的流行除受社会、自然和文化环境影响之外，其本身复杂多样的遗传结构亦是影响疟疾流行的重要原因。不同地理株间日疟原虫存在表型差异，多表现在药物抗性及毒力、生长繁殖、基因表达、入侵红细胞和配子体产生等方面。疟原虫裂殖子入侵宿主红细胞包括识别与粘附、定向、紧密接触等过程，需要裂殖子表面配体与红细胞表面受体相互作用，故参与疟原虫入侵宿主红细胞的裂殖子表面蛋白（Merozoitesurfaceprotein，MSP）是红内期疫苗研究的重要靶点。MSP3α基因属于MSP3基因家族，该家族是间日疟原虫入侵红细胞的关键蛋白。本专利技术研究分析中缅边境地区间日疟原虫PvMSP-3α基因的多态性特点及其影响因素，评估其在不同地理区域和不同人群中的多态性变化水平。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的特异性引物。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的方法。本专利技术要解决的技术问题之三是提供该鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的特异性引物在制备鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的检测工具中的应用。本专利技术首先提取待测间日疟原虫基因组DNA，然后通过对间日疟原虫PvMSP-3α基因进行PCR扩增，将所获得的扩增产物送测序，经序列比对后，得到多态性鉴定结果。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：本专利技术第一个方面是提供了一对鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的特异性引物（即用于间日疟原虫PvMSP-3α基因PCR扩增的特异性引物），其序列为：上游：5′-CTATTCGCACCGAACAGTCA-3′（如SEQIDNO：1所示）；下游：5′-ATCGCCCCAATTTGTCGTAT-3′（如SEQIDNO：2所示）。本专利技术第二个方面提供了一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的方法，包括如下步骤：1）提取待测间日疟原虫基因组DNA；2）间日疟原虫PvMSP-3α基因序列的扩增（用PCR技术从含有目的基因的间日疟原虫基因组DNA中获取间日疟原虫PvMSP-3α的DNA片段）：以SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列为引物，以提取的待测间日疟原虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增；3）分别将扩增产物送测序，经序列比对后，得到多态性鉴定结果。作为本专利技术优选的技术方案，步骤1）具体为：用打孔器将被间日疟原虫感染的病人的血滤纸片剪裁成多枚小片，放入离心管中，按照试剂盒的操作手册，提取待测间日疟原虫基因组DNA。作为本专利技术优选的技术方案，步骤2）中，所述PCR扩增的反应条件为98℃预变性3.0min，98℃变性10sec，60℃退火15sec，68℃延伸4.0min，35个循环；68℃延伸10min，最后保存于4℃。作为本专利技术优选的技术方案，步骤2）中，所述PCR扩增反应体系包括5xPrimeSTARGXLBuffer缓冲液5.0μl；2.5mMdNTPMixture2.0μl；10μM上游引物1.0μl；10μM下游引物1.0μl；DNA模板3.0μl；PrimeSTARGXLDNAPolymerase聚合酶0.5μl；无核酸酶水12.5μl。本专利技术第三个方面提供上述鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的特异性引物在制备鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的检测工具中的应用。本专利技术中提供的一对用于间日疟原虫PvMSP-3α基因PCR扩增的特异性引物，上游引物的序列是SEQIDNO：1所示的序列，所述下游引物的序列是SEQIDNO：2所示的序列，该特异性引物可以用于制备成专门鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的检测工具。检测工具包括生物检测领域中各种常见的产品，如基因芯片、试剂盒等。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术中筛选出的上下游引物与PCR扩增反应条件具有较强的特异性，条带单一，能准确检测出间日疟原虫的MSP-3α基因。经对比试验筛选，3组引物中，出乎意料地发现只有一组引物成功扩增出PvMSP-3α基因，其余2组引物皆未成功扩增出目的片段，且该组引物试验结果条带单一，特异性强，能准确检测出间日疟原虫的MSP-3α基因，达到了预料不到的技术效果。根据基因多态性区域特征，本专利技术设计特定的引物，经PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段，通过测序、分析，能够对PvMSP-3α基因是否突变进行鉴定，进而区分出是野生型还是突变型。采用本专利技术的特异性引物及检测方法能够有效的鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性。经鉴定，中缅边境地区32个样本PvMSP-3α基因中，野生型占25%（8/32），突变型占75%（24/32），NJ进化树见图2。π值为0.01601（见图3）；Ka/Ks值为0.37，为净化选择。附图说明图1是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因扩增结果示意图。图1中，M：DNA分子量标准；1-2：PCR产物。图2是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因NJ进化树分析图。图3是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性π值分析图。图4是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性Tajima’sD值的分析图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的鉴定1材料1.1间日疟原虫基因组DNA来自于被间日疟原虫感染的病人的血滤纸片，从中缅边境地区（Ch本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列是SEQ ID NO：1所示的序列，所述下游引物的序列是SEQ ID NO：2所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列是SEQIDNO：1所示的序列，所述下游引物的序列是SEQIDNO：2所示的序列。2.一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）提取待测间日疟原虫基因组DNA；2）间日疟原虫PvMSP-3α基因序列的PCR扩增：以SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列为引物，以提取的待测间日疟原虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增；3）分别将扩增产物送测序，经序列比对后，得到多态性鉴定结果。3.如权利要求2所述的鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的方法，其特征在于，步骤1）具体为：用打孔器将被间日疟原虫感染的病人的血滤纸片剪裁成多枚小片，放入离心管中，按照试剂盒的操作手册，提取待测间日疟原虫基因组DNA。4.如权利要求2所述的间...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈绅波，陈军虎，王越，沈海默，崔延冰，徐斌，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：上海,31
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