一种提高海藻糖合成酶产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高海藻糖合成酶产量的方法，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。此方法通过在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的linker连接氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的短肽大大提高了海藻糖合成酶在宿主细胞中的表达量，对于推动海藻糖的大规模工业化、降低海藻糖的生产成本具有重大的意义。

A Method for Increasing Trehalose Synthase Yield

The invention discloses a method for improving trehalose synthase production, belonging to the field of genetic engineering technology and enzyme engineering technology. This method greatly improves the expression of trehalose synthase in host cells by linker-linked amino acid sequences such as SEQ ID NO.3 and short peptides such as SEQ ID NO.4 at the N-terminal of trehalose synthase parents. It is of great significance to promote the large-scale industrialization of trehalose and reduce the cost of trehalose production.

【技术实现步骤摘要】
一种提高海藻糖合成酶产量的方法
本专利技术涉及一种提高海藻糖合成酶产量的方法，属于基因工程
以及酶工程

技术介绍
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1,1键结合而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫中。经研究发现，该糖具有独特的生物学功能，有保护生物大分子，保护细胞膜，保护蛋白质免受冷冻、干燥及渗透压变化等造成的破坏的作用，在食品、医药、化妆品、农业等领域均具有广泛应用。我国海藻糖的生产起步比较晚，以前主要靠日本进口，但是，进口海藻糖的价格高达每吨4～5万元，对于工业生产来说十分昂贵，会大大增加企业的生产成本。近几年，山东天力、内蒙梅花、湖南汇升等公司已经相继开始自主生产海藻糖，市场规模每年在以1万吨的销量递增，市场前景非常广阔。但是，各公司的海藻糖都是新开发的产品，生产工艺各异，产品质量十分不稳定，尤其是在产量上，一直未达到领先水平，因此，急需找到一种提高海藻糖产量方法。早期商业化的海藻糖是从酵母中提取的。1990年价格约700美元/kg，提取率过低，成本过高；1995年日本利用双酶法实现工业化生产，使得海藻糖价格由原来的2万日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg；中国2002年首次以双酶法实现海藻糖的产业化，价格79元/kg。双酶法以淀粉为原料，在麦芽寡糖基海藻糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生产工艺复杂，难以推广，目前全世界只有几个公司能生产；而海藻糖合成酶以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，是相对经济的生产方法，但仍有很多问题需要研究解决，其中海藻糖合成酶的生产是关键。因此，挖掘提高海藻糖合成酶表达量的方法对于推动海藻糖的大规模工业化、降低产业成本具有重大的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种提高海藻糖合成酶产量的方法。此方法通过在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的linker连接氨基酸序列如SEQIDNO.4所示的短肽大大提高了海藻糖合成酶在宿主细胞中的表达量，对于推动海藻糖的大规模工业化、降低海藻糖的生产成本具有重大的意义。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种海藻糖合成酶突变体，在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的linker连接氨基酸序列如SEQIDNO.4所示的短肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述海藻糖合成酶亲本的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术提供了编码上述突变体的基因。本专利技术提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列、pET系列、或pGEX中的任意一种。本专利技术提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。本专利技术提供了上述突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在高效表达海藻糖合成酶以及生产海藻糖方面的应用。本专利技术提供了一种高效表达海藻糖合成酶的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到海藻糖合成酶。有益效果：本专利技术通过对来源于ThermobifidafuscaYX的海藻糖合成酶进行改造，大大提高了其在宿主细胞中的表达量(较野生型提高了1.9倍)，对于推动海藻糖的大规模工业化、降低海藻糖的生产成本具有重大的意义。具体实施方式下面结合具体实施例和对比例对本专利技术进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的检测方法如下：酶活检测方法：预热：取1.9mL的0.2％麦芽糊精溶液(DE9～13pH6.0磷酸盐缓冲液)于具塞试管中，置于50℃水浴锅中预热10min。反应：加入0.1mL稀释后的粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mLDNS，振荡均匀，终止反应；煮沸7min，冷却。测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀；在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。(酶活定义：每分钟相当于转化一微摩尔葡萄糖变为非还原性糖所需要的酶量。)海藻糖转化率检测方法：将实施例3中的反应产物稀释沉淀后用高效液相色谱(HPLC)测定其中海藻糖含量，计算转化率；转化率计算公式＝海藻糖质量/大米淀粉质量*100/％；HPLC检测条件：流动相(乙腈：水＝80：20)；流速：0.8mL/min，柱温40℃，NH2柱(APS-2HYPERSIL，ThermoScientific)，示差折光检测器(RID)。实施例1：突变体的构建(1)根据氨基酸序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示的短肽(分别命名为P1、P2、P3、P4、P5)，化学合成其基因并分别连接至氨基酸序列分别如SEQIDNO.9所示的海藻糖合成酶基因序列的N端，并将其克隆至质粒pET24a(+)的XhoI和HindⅢ酶切位点之间，构建得到重组质粒pET24a(+)/P1-enzyme、pET24a(+)/P2-enzyme、pET24a(+)/P3-enzyme、pET24a(+)/P4-enzyme、pET24a(+)/P5-enzyme；(2)根据氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的linker(分别命名为L1、L2、L3)，化学合成其基因并分别连接至pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-T/L1、pMD18-T/L2、pMD18-T/L3；(3)以上述重组质粒为模板，设计引物并通过PCR获得线性化的(1)中所述的重组质粒片段以及(2)中所述的linker片段，将得到的两种片段进行同源重组，获得混合质粒(或直接通过化学合成得到短肽、linker以及海藻糖合成酶基因连接后的片段并克隆至质粒pET24a(+)的XhoI和HindⅢ酶切位点之间，获得混合质粒)。实施例2：突变体的验证将混合质粒以及转化E.coliBL21(DE3)宿主菌，于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，在37℃摇床中培养48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液即为粗酶液。将得到的粗酶液进行酶活检测，得到粗酶液酶活较含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌更高的重组菌，这些重组菌分别含有重组质粒pET24a(+)/P1-L3-enzyme、pET24a(+)/P3-L2-enzyme、pET24a(+)/P2-L3-enzyme以及pET24a(+)/P5-L1-enzyme。将含有重组质粒pET24a(+)/P1-L3-enzyme、pET24a(+)/P3-L2-enzyme、pET24a(+)/P2-L3-enzyme以及pET24a(+)/P5-L1-enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活与含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶进行比较。结果如下：含有重组质粒pET24a(+)/P1-L3-enzyme、pET24a(+)/P3-L2-enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活较含有重组质粒pET24a(+)/e本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的linker连接氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的短肽。

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的linker连接氨基酸序列如SEQIDNO.4所示的短肽。2.如权利要求1所述的海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述海藻糖合成酶亲本的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。3.如权利要求1或2所述的海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。4.编码权利要求1-3任一所述突变体的基因。5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。6.如权利要求5所述的重组质粒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢艳萍，黄海军，钟红霞，
申请(专利权)人：湖南汇升生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43