一种大熊猫粪便代谢组的分析方法技术

本发明专利技术提供了一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，属于生物技术和代谢组技术领域。本发明专利技术提供的大熊猫粪便代谢组的分析方法，通过将样品与内标溶液混合溶解，然后真空干燥，通过衍生化，然后通过衍生化处理后；通过气相色谱‑质谱分析，能精确的分析大熊猫粪便的，对大熊猫的代谢情况进行跟踪；具有较好的研究和利用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种大熊猫粪便代谢组的分析方法
本专利技术涉及生物技术和代谢组
，具体而言，涉及一种大熊猫粪便代谢组的分析方法。
技术介绍
代谢组学是一套完整的低分子量化合物的研究，是研究肠道代谢活动的理想组学方法。微生物分泌的许多代谢产物、激素和维生素，可被宿主重新吸收，并影响循环代谢产物，如已被证明分别与胰岛素抵抗和肠综合征有关的支链氨基酸和三叶因子3。粪便代谢组提供了关于肠道菌群、饮食和宿主之间代谢相互作用的相关信息。与16S下代测序相结合，代谢组能够提供宿主-微生物组相互作用的综合表型。大熊猫是中国最具代表性的熊之一，被视为国家财富的象征。即使有了这种旗舰地位，大熊猫仍然是一种依赖保护的脆弱物种，世界各地的动物园和繁育中心都在保护着数百只大熊猫。由于雌性大熊猫没有足够的母乳来喂养这两只幼崽，常常采用母乳和人工配方奶混合喂养。与此同时，成年大熊猫主要以竹子为食，因此成年大熊猫的肠道菌群适应于以竹子为食的饮食，这种适应是最能消化纤维素的。但目前还没有关于大熊猫粪便代谢组的研究报告。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，通过分析大熊猫的粪便的代谢组，能较好的跟着大熊猫的代谢情况。为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，包括以下步骤：取大熊猫粪便样品与萃取溶剂-内标混合液混合，得到混合样本；并研磨混合样本，初次离心取上清液样品，浓缩干燥得到粉末样品；将粉末样品、氢氧化钠、甲醇和吡啶溶液混合溶解，得到衍生化初样；将氯甲酸甲酯分两次加入衍生化初样中，并涡旋25-35s混合，加入氯仿和碳酸氢钠溶液涡旋8-15s混合，得到衍生化样本；离心衍生化样本并取下层氯仿层样品进行气相色谱-质谱分析。与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：本专利技术提供的大熊猫粪便代谢组的分析方法，通过将样品与内标溶液混合溶解，然后真空干燥，通过衍生化，然后通过衍生化处理后；通过气相色谱-质谱分析，能精确的分析大熊猫粪便的，对大熊猫的代谢情况进行跟踪；具有较好的研究和利用价值。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。说明书中um表示单位amu，Atomicmassunit，扫描速度μ/s表示unifiedatomicmassunitdalton(symbol:u)persecond。下面对本专利技术实施例的一种大熊猫粪便代谢组的分析方法进行具体说明。一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，包括以下步骤：取大熊猫粪便样品与萃取溶剂-内标混合液混合，得到混合样本；并研磨混合样本，初次离心取上清液样品，浓缩干燥得到粉末样品；将粉末样品、氢氧化钠、甲醇和吡啶溶液混合溶解，得到衍生化初样；将氯甲酸甲酯分两次加入衍生化初样中，并涡旋25-35s混合，加入氯仿和碳酸氢钠溶液涡旋8-15s混合，得到衍生化样本；离心衍生化样本并取下层氯仿层样品进行气相色谱-质谱分析。通过对大熊猫的粪便进行衍生化处理，并进行气相色谱-质谱分析，就能得到较为准确的大熊猫的代谢情况。由于大熊猫的饮食结构变化会影响代谢情况，因此通过分析不同年龄的大熊猫和不同阶段的大熊猫，可以分析大熊猫不同的饮食习惯；以及可以检测幼年大熊猫的饮食结构，分析幼年大熊猫对纤维素消化的情况。在本专利技术的一些实施例中，气相色谱-质谱分析的毛细管柱是ZB-1701(30m×250μm×0.15μm，含5米保护柱)；分析中电子碰撞电离能为65-75eV。通过高效的分析，能得到较为准确的实验数据；通过65-75eV的电子碰撞电离能可以较为全面分析代谢数据。在本专利技术的一些实施例中，在290℃时，氦气流的流速为0.8-1.2mL/min；辅助、质谱四极和质谱源的温度为240-255℃、225-235℃和145-155℃；扫描速度为1.562μ/s；溶剂延迟时间为5-6.5min。在氦气流的流速为0.8-1.2mL/min的情况下，通过高温气化，然后通过电离，使得单个分子电离二离子化，能方便的得出样本中的分子的种类及分子含量；专属性强、灵敏度高以及检测速度较快；方便高通量的分析。在本专利技术的一些实施例中，研磨混合样本的频率为30Hz，时间为150-200s，且在研磨前加入研磨珠，初次离心的速度为15000g-18000g，时间为12-18min。加入研磨珠，有利于样品能通过一定频率的研磨，能将样品研磨成合适粒径的悬液；通过30Hz的频率能将样本均匀的研磨，有利于后续的电离和分析。通过12-18min的高速离心，能将代谢物和残渣很好的分离，避免残渣影响分析结果。在本专利技术的一些实施例中，浓缩干燥得到粉末样品采用真空浓缩干燥，浓缩干燥时间为150-200min。通过真空浓缩干燥，避免代谢物发生附加的化学反应被氧化等，能较好、较真实的保证样本的实际情况。保证实际测得的数据能真实的反应实际的代谢情况。在本专利技术的一些实施例中，氢氧化钠、甲醇和吡啶按照6:5:1的体积比加入到粉末样品中。加入氢氧化钠、甲醇和吡啶能较好的保证样品中的代谢物能稳定的被保存。在本专利技术的一些实施例中，离心衍生化样本的速度为1400rpm-1700rpm，时间为250-320s，温度为4℃。通过离心处理，能将衍生化后的样品溶解于溶剂中，通过离心后，能将溶解于氯仿的样品分离。在本专利技术的一些实施例中，氯仿和碳酸氢钠溶液按照1:1的体积比加入。通过氯仿和碳酸氢钠能有效的将代谢物溶解，形成待检样本，方便进行检测分析。在本专利技术的一些实施例中，萃取溶剂-内标混合液依次为甲醇80％，异丙醇:乙腈:水(3:2:2)，甲醇(100％)，甲醇:氯仿(3:1)，乙腈(100％)和乙腈:氯仿(3:1)中的一种。通过不同的萃取溶剂-内标混合液，能将代谢物中的各种分子进行提取，最大限度的提取代谢物，避免漏检问题的发生。在本专利技术的一些实施例中，碳酸氢钠溶液的浓度为40-55mmol/L。通过合适浓度的碳酸氢钠，能起到一定的缓冲作用，也能保护样本不被破坏。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，通过本方法能对大熊猫的代谢情况进行分析，并可以对大熊猫的代谢情况进行连续跟踪，通过纵向比较，可以分析其代谢情况的发展趋势；通过不同大熊猫的代谢情况横向比较，可以对风险进行预测；方法包括以下步骤：1.1取大熊猫的粪便进行干燥，干燥大约5h，得到粪便干燥样品；1.2将粪便干燥样品研磨后混匀后，称量10mg样品，加入螺旋帽管中；1.3在螺旋帽管中，加入600μL的甲醇做萃取-内标溶液，进行混合，得到混合样本；1.4在每个混合样本的螺旋帽管中加入金属或陶瓷研磨珠，用研磨仪在30Hz的频率下，进行研磨并混合样品，150s；然后15000g离心12min，取上清液；1.5将上清液进行真空冷冻浓缩干燥150min，得到粉末样品；1.6将200μL的氢氧化钠、167μL甲醇和34μL的吡啶溶液与粉末样品混合溶解，得到衍生化初样；1.7将衍生化初样与20μL氯甲酸甲酯混合并涡旋2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：取大熊猫粪便样品与萃取溶剂‑内标混合液混合，得到混合样本；并研磨所述混合样本，初次离心取上清液样品，浓缩干燥得到粉末样品；将所述粉末样品、氢氧化钠、甲醇和吡啶溶液混合溶解，得到衍生化初样；将氯甲酸甲酯分两次加入所述衍生化初样中，并涡旋25‑35s混合，加入氯仿和碳酸氢钠溶液涡旋8‑15s混合，得到衍生化样本；离心所述衍生化样本并取下层氯仿层样品进行气相色谱‑质谱分析。

【技术特征摘要】
1.一种大熊猫粪便代谢组的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：取大熊猫粪便样品与萃取溶剂-内标混合液混合，得到混合样本；并研磨所述混合样本，初次离心取上清液样品，浓缩干燥得到粉末样品；将所述粉末样品、氢氧化钠、甲醇和吡啶溶液混合溶解，得到衍生化初样；将氯甲酸甲酯分两次加入所述衍生化初样中，并涡旋25-35s混合，加入氯仿和碳酸氢钠溶液涡旋8-15s混合，得到衍生化样本；离心所述衍生化样本并取下层氯仿层样品进行气相色谱-质谱分析。2.根据权利要求1所述的大熊猫粪便代谢组的分析方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱分析的毛细管柱是ZB-1701(30m×250μm×0.15μm，含5米保护柱)；分析中电子碰撞电离能为65-75eV。3.根据权利要求2所述的大熊猫粪便代谢组的分析方法，其特征在于，在290℃时，氦气流的流速为0.8-1.2mL/min；辅助、质谱四极和质谱源的温度为240-255℃、225-235℃和145-155℃；扫描速度为1.562μ/s；溶剂延迟时间为5-6.5min。4.根据权利要求1所述的大熊猫粪便代谢组的分析方法，其特征在于，研磨所述混合样本的频率为30Hz，时间为15...

【专利技术属性】
技术研发人员：张华，韩顶立，尹彦强，杨洋，菲利普贝克，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50