Warfarin Individualized Drug Use Related Gene Polymorphism Detection Kit and its preparation method and application involve the detection of gene polymorphism. The detection kit consists of a box, a separator, a lid, a WP-PCR mixed liquid bottle, a WP enzyme mixed liquid bottle, a WP standard control bottle, a WP negative control bottle, an amplification reagent and a control reagent. Preparation of amplification reagent; preparation of control reagent, the control reagent includes MP standard control and MP negative control; the amplification reagent and control reagent are set in the box, that is, warfarin individual drug-related gene polymorphism detection kit. The application of warfarin individualized drug use related gene polymorphism detection kit in the detection of warfarin individualized drug use related gene polymorphism loci genotype. Simple, fast, single reaction can detect multiple loci, which takes less time.
【技术实现步骤摘要】
华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因多态性的检测，尤其是涉及华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
华法林是一种香豆素类口服抗凝药，通过抑制维生素K及其2，3-环氧物(即维生素K环氧化物)的相互转化而发挥抗凝作用。华法林是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药，在临床使用近60年，主要用于预防和治疗静脉血栓、心肌梗塞、缺血性休克、肺栓塞等多种血栓性疾病和心脏人工瓣膜置换术、人工血管移植术等。由于华法林治疗窗较窄(剂量不足有血栓风险，过量服用可出现致命性出血)、个体间剂量差异大(达到适宜抗凝效果的个体间剂量差异可达10～20倍)、受药物或食物影响较大，使得它位居严重不良反应药物的前10名。研究表明，华法林的剂量需求受两方面因素影响：一是非遗传因素，主要包括年龄、性别、身高、体重、疾病状态、合并用药等；二是遗传因素，主要包括与华法林药代动力学和药效学相关的蛋白或酶的基因多态性，影响蛋白的表达或酶的活性，从而增加或降低华法林的疗效，是不同个体间的用量产生差异。近年来国内外多项研究显示，遗传因素是造成个体间华法林维持剂量差异的主要原因之一[1,2]，这些遗传因素包括CYP2C9、VKORC1、CYP4F2等约30个基因上的基因多态性位点。华法林在体内代谢的关键酶为肝脏细胞色素氧化酶P450超家族的第二亚家族的CYP2C9蛋白，该酶将华法林代谢为无活性成分。人CYP2C9基因具有遗传多态性，其中中国人群常见的多态性包括CYP2C9*3(rs1057910)[3,4]、CYP2C9C-65(rs933...
【技术保护点】
1.华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、盒盖、WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶、WP阴性对照瓶、扩增试剂和对照试剂；所述隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶和WP阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内；所述扩增试剂设有WP PCR混合液和WP酶混合液，所述WP PCR混合液装在WP PCR混合液瓶内，WP酶混合液装在WP酶混合液瓶内；所述对照试剂包括WP标准对照和WP阴性对照，所述WP标准对照装在WP标准对照瓶内，WP阴性对照装在WP阴性对照瓶内。
【技术特征摘要】
1.华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、盒盖、WPPCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶、WP阴性对照瓶、扩增试剂和对照试剂；所述隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，WPPCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶和WP阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内；所述扩增试剂设有WPPCR混合液和WP酶混合液，所述WPPCR混合液装在WPPCR混合液瓶内，WP酶混合液装在WP酶混合液瓶内；所述对照试剂包括WP标准对照和WP阴性对照，所述WP标准对照装在WP标准对照瓶内，WP阴性对照装在WP阴性对照瓶内。2.如权利要求1所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述WPPCR混合液包括1.25×PCR缓冲液、3.75mMMgCl2、0.25mMdATP、0.25mMdCTP、0.25mMdGTP、0.25mMdTTP、0.25mMdUTP、0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.75μMCYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、0.075μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.75μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、1.25μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.125μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、0.075μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.75μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4、0.25μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.275μMVKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.15μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和0.25μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4；所述WP酶混合液包括5U/μLTaqDNA聚合酶和0.1U/μLUNG酶；所述PCR缓冲液可采用SSPPCR缓冲液或其它类型的PCR缓冲液。3.如权利要求2所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述CYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、VKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、VKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、CYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、CYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、CYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4和CYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4的长度均为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～75℃。4.如权利要求2所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述CYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：5′-ATCCCCAAAGGTGCTCACAG-3′(SEQIDNO.1)；所述CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为：5′-CCTTGGAATGGACAAAAACAG-3′(SEQIDNO.2)；所述VKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：5′-AGAGGGAAATATCACAGACGCCAG-3′(SEQIDNO.3)；所述VKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：5′-GTGATCCACCCACCTC-3′(SEQIDNO.4)；所述CYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3为上游引物，其碱基序列为：5′-GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG-3′(SEQIDNO.5)；所述CYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3为下游引物，其碱基序列为：5′-AGGATGAAAGTGGGATCACAGG-3′(SEQIDNO.6)；所述CYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4为上游引物，其碱基序列为：5′-GATTGGCAGAAACCGGAG-3′(SEQIDNO.7)；所述CYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4为下游引物，其碱基序列为：5′-CTTACCTTGGGAATGAGATAGT-3′(SEQIDNO.8)。5.如权利要求2所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4均为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，所述靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标；所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4均为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。6.如权利要求5所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述荧光基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluorGold540、JOE、HEX、CALFlourOrange560、TAMRA、CalFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TEXASRED、CALFlourRed635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar705中的一种；所述淬...
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