马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用制造技术

本发明专利技术提供了马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用；通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以低温糖化抗性基因型马铃薯“10908‑06”4℃贮藏15d后的块茎cDNA为模板，克隆了CISR1基因，并构建超量表达载体，遗传转化马铃薯鄂薯3号进行转基因功能验证，发现超量表达CISR1基因能够提高其抗低温糖化的能力。

【技术实现步骤摘要】
马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用
本专利技术属于分子遗传育种领域，具体的说是马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用。
技术介绍
马铃薯是继玉米、小麦和水稻之后的世界第四大粮食作物。在马铃薯油炸加工业中，为了延长加工周期和抑制常温贮藏导致的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等现象，常将块茎长期贮藏在低温条件下。但是低温会影响块茎内碳水化合物的代谢，加速淀粉裂解转化为可溶性糖(葡萄糖和果糖)，这种现象称为“低温糖化”。适合油炸加工的马铃薯主要依赖于产品的色泽，而还原糖含量决定了约93％的油炸产品色泽变异。在油炸加工过程中，还原糖与氮化合物的α-氨基酸进行“MaillardReaction”致使油炸产品表面颜色加深，严重影响加工品质。更严重的是，“MaillardReaction”反应过程中还形成丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种潜在的致癌物，对人体具有神经和遗传毒性的影响，引起世界范围内食品安全的关注。耐低温糖化马铃薯油炸加工品种匮乏严重阻碍了加工业的快速发展。减少还原糖含量不仅能够减低丙烯酰胺含量，而且还能解决加工产品色泽问题，是改良马铃薯加工品质的一个有效途径。现有技术存在的问题：根据RNA-seq数据及共表达实验筛选出CISR1转录因子，目前，关于CISR1在马铃薯块茎低温糖化代谢过程中的作用并无相关文献报道。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用；通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以低温糖化抗性基因型马铃薯“10908-06”4℃贮藏15d后的块茎cDNA为模板，克隆了CISR1基因，并构建超量表达载体，遗传转化鄂马铃薯3号进行转基因功能验证，发现超量表达CISR1基因能够提高其抗低温糖化的能力。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：马铃薯RNA-seq分析与低温糖化基因筛选：本专利技术选取了低温糖化抗性基因型“10908-06”和低温糖化敏感基因型“鄂马铃薯3号(E3)”，种植于温室。马铃薯块茎收获后，室温遮光放置10天，选单个薯块重量大于50g、无病虫害和无机械损伤的块茎，分为两份，一份20℃贮藏0d、5d、15d，另一份4℃贮藏5d、15d，分别取样。取样时将块茎去皮切成小块速冻于液氮，保存于-70℃。参照天根生化科技(北京)有限公司(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取上述所取样品的RNA，送于华大基因进行转录组测序(参考CN201510010458.X、CN201010213759.X、CN201610639522.5)。分析低温糖化抗性和敏感基因型贮藏块茎低温应答的表达谱数据，发现CISR1在抗感材料中的表达模式不一致，表达谱数据结果如下表所示(基因的表达量单位为FPKM)。马铃薯CISR1基因，其通过如下步骤克隆得到：(1)引物设计根据马铃薯基因组序列信息(PGSC0003DMG400016812)，用SnapGene2.3.2软件设计扩增该基因CDS序列的引物。(2)RNA提取与反转录参照天根(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取低温糖化抗性基因型马铃薯10908-064℃贮藏15d后的块茎RNA，根据TOYOBO反转录试剂盒(CodeNo.FSQ-101)进行反转录获得cDNA。(3)PCR反应、克隆载体构建和测序根据合成的引物以上述cDNA为模板PCR扩增CISR1基因，胶回收扩增片段，进行TOPO克隆，菌液检测并测序，测序正确后命名为TOPO-CISR1。马铃薯CISR1基因在抗低温糖化中的应用，包括如下步骤：(1)植物表达载体构建将TOPO-CISR1质粒与超量表达载体pJCV55进行LR反应，随后转化大肠杆菌，PCR检测，测序。测序正确的目标载体命名为pJCV55-CISR1，然后该质粒热激转化至农杆菌LBA4404中，菌检获得阳性克隆。(2)马铃薯遗传转化将CISR1的植物表达载体转入农杆菌菌株LBA4404中，参照Si等(Sietal.,2003)的方法进行遗传转化。(3)抗低温糖化功能验证将获得的转基因株系及对照E3试管苗种植于温室，薯块收获后，将鲜重大于50g的块茎分别于4℃贮藏30d，然后取样测定CISR1的相对表达量、还原糖含量(RScontent)、蔗糖含量(Succontent)及酸性转化酶活性(VINVactivity)，上述测定采用张迟2007的方法。附图说明图1：4℃贮藏30d转基因块茎中CISR1基因的相对表达量；图2：4℃贮藏30d转基因块茎中还原糖及蔗糖含量；图3：4℃贮藏30d转基因块茎中酸性转化酶活性。具体实施方式为使专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本专利技术的实施方式仅仅是示例性的，并且本专利技术并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本专利技术的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例1该实施例提供马铃薯CISR1基因及其克隆方法，具体包括如下步骤：(1)引物设计本专利技术中的CISR1基因根据马铃薯基因组数据库公布的序列(PGSC0003DMG400016812)设计引物扩增该基因的CDS全长序列，引物序列如下：CISR1F(5’-CACCATGTGTGGAGGTGCCATAATCT-3’)CISR1R(5’-ATAGAACTGATGCTGAGTTGAAGCA-3’)另外基于CDS序列设计了CISR1的定量引物，引物序列如下：qCISR1F(5’-GATCCTCAGAAGGGTGTCCG-3’)qCISR1R(5’-TGTCACCACGAATGCGCTTA-3’)(2)RNA提取与反转录参照天根(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取低温糖化抗性基因型马铃薯10908-06块茎4℃贮藏15d后的块茎RNA，根据TOYOBO反转录试剂盒(CodeNo.FSQ-101)进行反转录获得cDNA。(3)PCR反应和克隆载体构建通过PCR的方法，以低温糖化抗性基因型马铃薯10908-06为模板，扩增CISR1的CDS序列(795bp)，反应程序为：95℃，30s；95℃，15s；55℃，15s；72℃，30s；33个循环(2-4步)；72℃，10min；4℃forever。胶回收相应目标片段后连接至TOPO载体上，然后转化至大肠杆菌DH5α，挑斑，菌液检测，送往英潍捷基(上海)贸易有限公司测序验证，阳性质粒提取。实施例2该实施例是将实施例1中得到克隆载体进行低温糖化抗性广泛性的验证；具体验证步骤如下：(1)植物表达载体构建参照LR试剂盒(Invitrogene，USA)说明书将TOPO-CISR1质粒与超量表达载体pJCV55进行LR反应，随后转化大肠杆菌，PCR检测，测序。测序正确的目标载体命名为pJCV55-CISR1，然后该质粒热激转化至农杆菌LBA4404中，菌检获得阳性克隆。(2)马铃薯遗传转化将OE-CISR1超量表达的农杆菌LBA4404划线于YEB固体培养基上进行活化，挑取单克隆于20mlYEB液体培养基中，28℃200rpm培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.马铃薯CISR1基因，其特征在于，所述CISR1基因CDS序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.马铃薯CISR1基因，其特征在于，所述CISR1基因CDS序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的马铃薯CISR1基因，其特征在于，CISR1基因通过如下步骤克隆：(1)引物设计；(2)RNA提取与反转录；(3)PCR反应、克隆载体构建和测序。3.马铃薯CISR1基因在抑制马铃薯低温贮藏下的还原糖含量中的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勋，史伟玲，宋波涛，尹旺，沈昱辰，刘田田，刘腾飞，王季春，
申请(专利权)人：西南大学，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50