一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体技术

本发明专利技术公开了一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体。该方法采用由杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体进行检测；杂交瘤细胞株2D53D12在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15195。采用地塞米松抗体进行检测采用酶联免疫吸附法进行。实验证明，利用由杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体可以检测地塞米松，不仅灵敏度高，而且特异性好。本发明专利技术具有重大的应用价值。

A METHOD FOR DEXAMETHASONE DETECTION AND ITS SPECIAL MONOCLONAL ANTIBODY

The invention discloses a method for detecting dexamethasone and a special monoclonal antibody thereof. Monoclonal antibodies secreted by hybridoma cell line 2D53D12 were used to detect the hybridoma cell line. The preservation number of hybridoma cell line 2D53D12 in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee was CGMCC No. 15195. Dexamethasone antibody was detected by ELISA. Experiments show that dexamethasone can be detected by using monoclonal antibodies secreted by hybridoma cell line 2D53D12, which has high sensitivity and specificity. The invention has great application value.

【技术实现步骤摘要】
一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体，尤其涉及一种检测化妆品中地塞米松的方法及其专用单克隆抗体。
技术介绍
地塞米松(别名为氟美松、氟甲强地松龙或德沙美松)的化学名称为16α-甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮，CAS登录号为24916-90-3，分子式为C22H28O5，相对分子量为392，化学结构式见式(I)。地塞米松对皮肤疾病(如湿疹)有良好的疗效，甚至对由皮肤炎症引起的严重斑块牛皮癣也能起到缓解作用。因此，地塞米松被用于进行临床治疗。但是长期大剂量使用或者长期局部使用强效地塞米松，会引发依赖性，使血管扩张，皮肤形成红色斑点，副作用很多。有不良商家在化妆品(如面膜、面霜、药膏、乳液)中添加地塞米松以代替成本较高的功效添加物，使消费者在使用后的皮肤状态能在短期内有明显改善，但是容易造成依赖性，还可能引发皮炎或其它更严重的疾病，因此地塞米松已被列为化妆品禁用物质。目前，已有相关规定禁止地塞米松等41种糖皮质激素在化妆品中添加。但近几年来的抽检活动中，仍然有大量违禁添加的化妆品被检出。为净化市场，保障消费者的合法权益，有必要建立高效、灵敏的检测地塞米松的方法。地塞米松检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法(ELISA方法)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS联用法)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS联用法)。薄层色谱法虽然能够进行简单的定性分析，但其灵敏度较低。GC-MS联用法检测地塞米松时，需经过一些列衍生化反应使激素获得挥发性，所以采用GC-MS联用法检测地塞米松具有较大的困难。LC-MS联用法是GB/T24800.2-249采用的检测化妆品中41种糖皮质激素的方法，在动物饲料和组织的检测中也有广泛的应用；LC-MS联用法不需要对样品进行衍生化处理，前处理过程略微简单一点，但其余操作过程仍然非常复杂。GC-MS联用法要求分析物具有挥发性，LC-MS联用法对分析物没有此类要求，但也需要具有较高的纯度避免损害仪器，这两种方法使用的仪器价格均比较高昂，日常维护的成本也很高，还需要掌握实验操作技能的技术人员来使用。相比之下，ELISA方法使用的仪器设备更实用，且对样品纯度要求也不高，前处理过程简便，整体操作简单易行，且比薄层色谱法灵敏度更高，常被用来检测动物尿液、组织和饲料中的糖皮质激素。此外，虽然已有关于地塞米松的单克隆抗体报道，但化妆品剂型多样，基质复杂，还未有采用ELISA方法检测化妆品中的地塞米松的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测地塞米松的方法，尤其是检测化妆品中的地塞米松含量的方法。本专利技术首先保护杂交瘤细胞株2D53D12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.15195。本专利技术还保护由所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体。本专利技术还保护一种检测地塞米松的方法，可包括步骤a4)：采用地塞米松抗体进行检测；所述地塞米松抗体为以式(II)所示的化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备的抗体；上述方法中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。上述方法中，式(II)所示的化合物与载体蛋白通过酰胺键连接。所述酰胺键是式(II)所示的化合物的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。所述偶联物可为地塞米松-卵清白蛋白偶联物(式(III)所示化合物)或地塞米松-牛血清白蛋白偶联物(式(IV)所示化合物)。地塞米松-卵清白蛋白偶联物的制备方法可如下：(1)将式(II)所示的化合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺用有机溶剂溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)向含卵清白蛋白的磷酸盐缓冲液中滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-卵清白蛋白偶联物。地塞米松-卵清白蛋白偶联物的制备方法具体可如下：(1)将9.8mg式(II)所示的化合物、9.0mgN-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺用0.4mL二甲基亚砜溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)取18mg卵清白蛋白，加入5mLpH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-卵清白蛋白偶联物。地塞米松-牛血清白蛋白偶联物的制备方法可如下：(1)将式(II)所示的化合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺用有机溶剂溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)向含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-牛血清白蛋白偶联物。地塞米松-牛血清白蛋白偶联物的制备方法具体可如下：(1)将9.8mg式(II)所示的化合物、9.0mgN-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺用0.4mL二甲基亚砜溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)取26mg牛血清白蛋白，加入5mLpH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-牛血清白蛋白偶联物。上述方法中，所述地塞米松抗体可为a1)或a2)或a3)：a1)由所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体；a2)所述免疫原免疫动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；a3)所述免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体。上述方法中，所述动物可为小鼠、兔、山羊、绵羊或马中的任一种。上述方法中，所述“采用地塞米松抗体进行检测”可采用酶联免疫吸附法进行。上述方法中，当检测化妆品中的地塞米松时，还可包括步骤a1)-a3)：a1)向化妆品中加入乙腈，超声提取；a2)完成步骤a1)后，离心，收集上清液；a3)完成步骤a2)后，取所述上清液，氮气吹干，加入磷酸盐缓冲液溶解；在进行所述步骤a4)前先进行所述步骤a1)-a3)。所述步骤a1)中，化妆品和乙腈的比例具体可为1g：1-3mL(如1-2mL、2-3mL、1mL、2mL或3mL)。所述步骤a1)中，超声提取的时间可为5-15min(如5-10min、10-15min、5min、10min或15min)。超声提取的参数可为频率50Hz，温度16-25℃。所述步骤a1)中，还可加入饱和NaCl溶液。所述化妆品、饱和NaCl溶液和乙腈的比例具体可为1g：2-4mL(如2-3mL、3-4mL、2mL、3mL或4mL)：1-3mL(如1-2mL、2-3mL、1mL、2mL或3mL)。本专利技术还保护一种产品，其可含有b1)或b2)或b3)；b1)式(II)所示的化合物；b2)上述任一所述偶联物；b3)上述任一所述地塞米松抗体。所述产品的应用也属于本专利技术的保护范围。所述产品的应用可为S1)或S2)：S1)检测地塞米松；S2)制备用于检测地塞米松的试剂盒。上述应用中，所述试剂盒可为酶联免疫吸附试剂盒。本专利技术还保护式(II)所示的化合物的制备方法。式(II)所示的化合物的制备方法可为将式(I)所示化合物、吡啶和丁二酸酐混合，搅拌，获得式(II)所示的化合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.杂交瘤细胞株2D53D12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15195。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株2D53D12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.15195。2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体。3.一种检测地塞米松的方法，包括步骤a4)：采用地塞米松抗体进行检测；所述地塞米松抗体为以式(II)所示的化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备的抗体；4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述地塞米松抗体为a1)或a2)或a3)：a1)由权利要求1所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体；a2)所述免疫原免疫动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；a3)所述免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述“采用地塞米松抗体进行检测”采用酶联免疫吸附法进行。6.如权利要求3至5任一所述的方法，其特征在于：当检测化妆品中的地塞米松时，还包括步骤a1)-a3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，郭立群，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京,11