一种降钙素原抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种降钙素原抗体的制备方法，该方法包括动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的准备、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、杂交瘤细胞的筛选、阳性杂交瘤细胞的亚克隆、大规模制备PCT单抗、PCT抗体的纯化、鉴定单抗特性等步骤，本发明专利技术制备方法简单有效，制备的PCT单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，与PCT具有良好的结合能力，可以用于PCT的功能研究，也可以用于开发基于PCT的诊断试剂，为细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控提供帮助。

Preparation of procalcitonin antibody

The invention discloses a preparation method of procalcitonin antibody, which includes animal immunity and preparation of spleen cells, preparation of myeloma cells, fusion of immune spleen cells and myeloma cells, screening of hybridoma cells, subcloning of positive hybridoma cells, large-scale preparation of PCT monoclonal antibodies, purification of PCT antibodies, characterization of monoclonal antibodies, etc. The preparation method of the invention is simple. Effective. The monoclonal antibody of PCT has the characteristics of high specificity and sensitivity. It has good binding ability with PCT. It can be used to study the function of PCT. It can also be used to develop diagnostic reagents based on PCT. It can provide help for early diagnosis, differential diagnosis and treatment monitoring of bacterial infections.

【技术实现步骤摘要】
一种降钙素原抗体的制备方法
本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及一种降钙素原抗体的制备方法。
技术介绍
降钙素原(procalcitonin，PCT)是一种糖蛋白质，来自定位于第11号染色体上(11p15，4)的单拷贝基因。PCT是血清降钙素(CT)的前肽物质，PCT前体在内源多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116个氨基酸的PCT，分子量约为13kD。其分子结构为含57个氨基酸的N末端(N-ProCT)、含32个氨基酸CT(Cakitonin)和含21个氨基酸钙抑肽(Katacalcin)组成。在正常生理情况下，PCT是由甲状腺合成与分泌的，其在健康人体的血浆中的含量非常低(小于0.1ng/ml)，但是PCT蛋白在体内的稳定性很好，半衰期大约为20-24h。PCT在人体感染时受内毒素、TNF-α等细胞因子影响在多种组织均可产生，当严重细菌、脓毒症、多脏器功能衰竭时其在血浆中的水平升高，自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。PCT已被认为是一种用于细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控的最新特异性指标。因此，PCT的检测在临床诊断本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PCT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周，将PCT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ugPCT蛋白不加佐剂尾静脉注射，3d后，小鼠眼球采血，分离血清，保存备用，处死小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中，调整浓度为1×107个/mL；(2)骨髓瘤细胞的准备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI...

【技术特征摘要】
1.一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PCT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周，将PCT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ugPCT蛋白不加佐剂尾静脉注射，3d后，小鼠眼球采血，分离血清，保存备用，处死小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中，调整浓度为1×107个/mL；(2)骨髓瘤细胞的准备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞保持在对数生长阶段；(3)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，2000r/min离心5min,弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；50％聚乙二醇PEG40001mL，左手匀速转动融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mLDMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1000rpm/min离心10min，弃上清，加入20mLHAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；(4)细胞筛选：细胞长至孔底1/5面积时，对细胞上清液进行ELISA筛选阳性克隆杂交瘤细胞，并扩大培养；(5)亚克隆：采用软琼脂法对筛选的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆2-4次，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性PCT杂交瘤细胞株，将高特异性PCT杂交瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐静，陈星星，张伟，
申请(专利权)人：宁波奥丞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33