一种定量检测窖泥中甲烷菌含量的方法技术

本发明专利技术属于生物技术及食品发酵领域，是一种涉及利用特异性引物定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，本发明专利技术针对目标甲烷菌在某个分类层面(门纲目科属种六个分类层面均可以)上16S rDNA的特异性，设计出目标甲烷菌的特异性引物。该方法包含以下步骤：(1)目标甲烷菌特异性引物的设计；(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取；(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR(quantitative polymerase chain reaction)扩增来定量检测不同浓香型白酒窖泥样本中甲烷菌的含量。本发明专利技术基于目标甲烷菌16S rDNA的特异性SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)和SAP(simple allele discriminating PCR)技术设计属特异性PCR(polymerase chain reaction)引物的方法，提供了一种可行的从复杂菌群中利用特异性引物检测甲烷菌的分子生物学方法。

A Method for Quantitative Detection of Methanobacteria in Pit Mud

The invention belongs to the field of biotechnology and food fermentation, and is a method for quantitative detection of methanogens in pit mud of Luzhou-flavor liquor by using specific primers. The specific primers of target methanogens are designed for the specificity of 16S rDNA on a certain taxonomic level (six taxonomic levels of phylum, family and species). The method consists of the following steps: (1) design of specific primers for target methanogens; (2) collection of different pit mud samples and extraction of their macrogenomes; (3) QPCR (quantitative polymerase chain reaction) amplification of target methanogens specific primers for quantitative detection of methanogens in different Luzhou-flavor liquor pit mud samples. The present invention is based on the specific SNP (single nucleotide polymorphism) and SAP (simple allele discriminating PCR) technology of 16S rDNA of target methanogens, and provides a feasible molecular biological method for detecting methanogens from complex bacteria by using specific primers.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测窖泥中甲烷菌含量的方法
本专利技术属于生物技术及食品发酵领域，是一种涉及特异性引物定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法。
技术介绍
在白酒的酿造过程中，窖泥作为微生物的载体，发挥着重要的作用。窖泥中的各种微生物在发酵的厌氧条件下相互维持着群落的平衡，形成特殊的生态系统，对于酒类的发酵程度和风味塑造起着决定性的作用。随着分子生物学的发展，由于16SrRNA基因在物种进化过程中具备高度保守性，人们积极利用16SrRNA基因来确定微生物门纲目种属等分类学信息，对未培养或不能培养的微生物16SrRNA基因进行PCR扩增成为了主要的方法，特别是极端环境下生长的微生物，例如甲烷菌。甲烷菌是专性严格厌氧菌，生长繁殖特别缓慢，培养分离比较困难，在实验室模拟它们的生长条件是很困难的；而在以往对浓香型白酒窖泥菌群的系列分析结果表明，甲烷菌在产香等发酵过程中具有重要作用，所以需要对其进行深入研究。甲烷菌属在浓香型白酒窖泥中的含量分布情况比较类似，既有的检测报道一般是3-6个属。比如五粮液酒的窖泥中曾报道了4个优势甲烷菌属，分别为Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanoculleus和Methanosarcina，其中Methanosarcina可同时利用乙酸和H2。四川绵阳丰谷酒业的窖泥中含有至少5个甲烷菌属，分别是Methanoculleus(甲烷袋状菌属,本文称之为甲烷囊菌属，参见百度百科)、Methanosarcina(八叠球菌属)、Methanobacterium(甲烷杆菌属)、Methanocorpusculum(甲烷粒菌属)和Methanomicrobiaceae(甲烷微菌属)。四川泸州某公司白酒生产窖池中发现至少有6个甲烷菌属，分别是Methanobrevibacter、Methanosata、Methanoculleus、Methanobacterium、Methanocorpusculum和Methanothri，而泸州老窖的百年窖泥中至少含有4类不同的甲烷菌属，分别是甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)和甲烷囊菌属(Methanoculleus)。显然，不同的浓香型白酒在日常质控过程中需要对不同组合的甲烷菌属设计特异性(快速)检测技术。甲烷菌的特异性检测已经有不少报道。比如，韦艳霞等人试图研究根管感染中产甲烷古细菌的多样性，利用甲基辅酶M还原酶(methylcoenzymeMreductase，MCR)基因α亚基(mcrA)的特异性引物，发现所选样本中产甲烷古细菌的多样性局限于类口腔甲烷短杆菌序列型。华金玲等也是利用MCR基因特异性基因引物发现黄淮白山羊瘤胃中的甲烷菌主要是瘤胃甲烷杆菌。兰阿峰等利用甲烷菌16SrDNA特异性引物Met86F和Met1340R测定了野生秦岭羚牛瘤胃中甲烷菌种类，发现包括了至少3个科，若干个属，其多样性比较丰富。利用MCR等基因设计的甲烷菌特异性引物，以及利用甲烷菌核糖体基因Met86F和Met1340R等特异性引物的检测方法，理论上适合于大多数产甲烷菌，但是难以把不同的甲烷菌种属区分开来。在白酒研究领域也有若干甲烷菌特异性检测技术的报道，比如罗青春等运用已知特异性引物和荧光定量PCR测定了不同年份川酒窖泥中几种主要产甲烷菌的含量，发现随着窖泥年份的增加，3种产甲烷菌属甲烷鬃毛菌属(Methanosaeta)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)及甲烷杆菌属(Methanobacter)的含量均呈不同幅度的增加趋势。不过对这些已知特异性引物的原始文献进行勘察时发现它们是目(order)分类层面上的特异性引物，而且并未交待引物特异性的基本验证数据(比如基本的PCR跑胶及扩增产物测序等数据)。再如胡贝等设计了3对甲烷菌的属特异性引物，分别对应Methanobrevibacter，Methanoculleus和Methanosarcina，他们发现Methanoculleus这个属含量的时间变化规律在剑南春和水井坊各自的窖泥中有明显的差异。这3对引物经过特异性检查后发现满足设计要求，以这些窖泥DNA为模板的扩增产物经过测序验证发现都是设计的目标DNA序列。张会敏的高通量测序结果显示，古井贡酒窖泥包含的甲烷菌属至少有Methanosarcina(1-458),unkowngenus-1(1-2),unkowngenus-2(2-8),Methanofollis(3-896),Methanoculleus(16-14155),Methanocorpusculum(6-2180),Methanococcus(2-10),Methanobrevibacter(3-903)以及Methanobacterium(5-1514)，括号里面的两个数字分别是各自OTU(operatingtaxonomicunit)的个数及其序列总个数，显示古井贡酒窖泥中Methanoculleus这个属的序列复杂度及菌属含量在全部甲烷菌中相对都是最大的。在窖泥质量评估的方法体系中，甲烷菌属的特异性检测方法属于重要的建设内容。一般认为，甲烷菌利用H2还原CO2产生CH4,使菌群代谢平衡向促进有机酸、酒精生成的方向转化,促进了酒醅中的酸和酯的含量,也提高了产酒率。根据“种间氢转移”原理，甲烷菌属利用己酸菌发酵产生的氢用于产生甲烷，使己酸菌消除了氢的抑制而促进产酸，继而提高己酸乙酯含量.但是上述过程只能在窖池的有限的位置发生，因为只有一定深度下的窖池底部密封发酵一段时间以后才可能满足甲烷菌属的厌氧生长条件。甲烷菌促进白酒发酵质量的途径肯定是多方面的，理论上不同的甲烷菌属在窖泥-黄水-酒醅界面的厌氧发酵过程中发挥的作用与方式会有所不同。但是这些甲烷菌属到底通过哪些生物学途径发挥作用、甲烷菌属之间存在哪些重要的相互作用等问题还需要大量的研究才能逐步搞清楚，需要检测各个甲烷菌属在发酵动力过程中的含量变化。所以设计一批针对各个甲烷菌属的属或种或者其他分类层面上的特异性引物很有必要。SNP(singlenucleotidepolymorphism)标记作为第三代分子标记，在分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面发挥着重要作用。本专利基于目标菌属在16SrRNA中的SNP位点，结合MAFFT多序列比对技术和扩展性SAP引物设计技术，建立了复杂菌群中任意甲烷菌属的特异性引物设计方法。
技术实现思路
为弥补现有甲烷菌属分子鉴定及定量检测技术的不足，本专利技术提供了一种涉及利用特异性引物定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，本专利技术针对目标甲烷菌在某个分类层面(门纲目科属种六个分类层面均可以)上16SrDNA的特异性，设计出目标甲烷菌的特异性引物。该方法包含以下步骤：(1)目标甲烷菌特异性引物的设计；(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取；(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR(quantitativepolymerasechainreaction)扩增来定量检测不同浓香型白酒窖泥样本中甲烷菌的含量。本专利技术基于目标甲烷菌16Sr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，其特征在于该方法包含以下步骤：(1)目标甲烷菌特异性引物的设计；(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取；(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR扩增来定量检测不同样本中甲烷菌的含量。目标甲烷菌或目标甲烷菌属这里指六个分类层面(门纲目科属种)任意一个层面上的一组甲烷菌均可以。菌属字眼只是通俗的称谓，并不局限于属这个分类层面。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，其特征在于该方法包含以下步骤：(1)目标甲烷菌特异性引物的设计；(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取；(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR扩增来定量检测不同样本中甲烷菌的含量。目标甲烷菌或目标甲烷菌属这里指六个分类层面(门纲目科属种)任意一个层面上的一组甲烷菌均可以。菌属字眼只是通俗的称谓，并不局限于属这个分类层面。2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于目标甲烷菌特异性引物，其设计方法如下：以浓香型白酒窖泥中某个特定的的甲烷菌属为研究对象，经过对窖泥中含量最多的前三十个菌属的16SrRNA全长代表序列、目标甲烷菌属的16SrRNA全长代表序列和数据库搜索挑选的目标甲烷菌属16SrRNA全长其他序列使用MAFFT(MultipleAlignmentusingFastFourierTransform，https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)多序列比对分析，找出目标甲烷菌属的全部singlenucleicpolymorphism(SNP)位点。对全部SNP位点进行目标甲烷菌属内和菌属外可行性验证，找出3-5个最好的SNP位点，以此基础上再选择最佳的一个SNP位点进行特异性引物设计。原则上可以设计多对目标甲烷菌属特异性引物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用SNP位点和扩展性SAP(simpleallele...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁木，何宏魁，张治洲，蔡照润，曹润洁，李安军，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学威海，
类型：发明
国别省市：山东,37