一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法，属于体外检验技术领域，解决现有技术反应时间长、测量速度慢、线性范围窄、在被测物质浓度高时易发生勾状效应等技术问题。试剂盒包括以下试剂：固相试剂R1：含有T3类似物包被的顺磁性微球的悬液；液相试剂R2：含有吖啶酯标记的T3抗体的悬液；其中，R1中的顺磁性微球是表面包裹带有羧基活性基团的四氧化三铁，顺磁性微球的粒径大小为0.1～5μm。本发明专利技术提供的游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法，采用化学发光免疫分析法定量检测血清/血浆中的游离三碘甲状腺原氨酸，具有操作简便、灵敏度高、检测快速、线性范围宽、费用低廉、便于自动化等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及体外检验
，尤其涉及一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
甲状腺是一个内分泌腺体，它分泌的具有生物活性的甲状腺激素对机体的生理作用广泛而强烈。它能促进生长发育和组织分化，促进糖、脂肪、蛋白质的氧化分解，增大耗氧和产热效应，增加机体基础代谢率，对中枢神经系统、心血管及消化系统等均具有重要作用。甲状腺激素分泌量增加或减少均可导致甲状腺功能失调，内分泌代谢紊乱。因此，正确检测甲状腺相关激素，对诊断治疗甲状腺疾病具有重要意义。三碘甲状腺原氨酸(3,5,3’-L-三碘甲状腺原氨酸，T3)是由甲状腺合成、分泌，以及外围四碘甲状腺原氨酸(T4)转化而成的一种激素。在循环中99.7％的T3与运转蛋白(主要是甲状腺素结合球蛋白)可逆性地结合在一起，剩余少量的T3不与转运蛋白结合，这部分未结合的T3就是游离T3(FT3)，FT3可以通过细胞膜与受体结合发挥生理效应，因此它是甲状腺激素发生生理效应的真正活性部分，能较确切地反映甲状腺的功能状态及其他对人体技能的影响。且甲状腺的机制状态与循环中FT3的水平密切相关。所以FT3可以作为区别甲亢、甲减及甲状腺功能亚临床状态的重要指标。检测样品中FT3目前多采用标记T3类似物的方法。使用这种方法要求类似物与所测激素具有充分的化学相似性，即类似物要具有与T3抗体结合的活性，并且结合能力应与T3分子相同或相近，但却没有与TBG(甲状腺素结合球蛋白)及THBP等结合蛋白的结合活性，或者虽然有结合活性，但结合能力远远低于与T3抗体结合的能力。测定游离激素方法学的准确性与其它测定激素的方法的准确性概念上有差别，因为测定的是平衡体系中的游离部分，回收率和样品稀释都不好评估。在测定过程中结合激素对测定存在干扰。样品中激素的结合部分与游离部分处于一种动态平衡状态，而且结合部分的激素浓度远大于游离部分的浓度，与蛋白结合的T3浓度为FT3浓度的3000-5000倍。测定时，抗体结合游离激素就会对这种平衡造成微扰，体系要重新建立平衡，即结合的激素要解离一部分变成游离的，这样的结果是增加了游离激素的总量。然而这种平衡的变化对测定造成多大的干扰主要取决于二个因素，一个是激素与结合蛋白之间的结合常数和解离常数以及抗体与游离激素之间的结合常数，另一个是整个分析操作时间的长短。结合激素的解离常数要小，但无法改变这个常数，所以唯一可做的是选择高亲合力的抗体，它与激素的结合常数要大，这样也可以使分析过程在尽可能短的时间内完成，使结合激素对测定的干扰减少到最低水平。发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术，以发光物质作为底物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。在反应条件一定时，免疫反应的速度则只决定于分子的运动速度和反应的表面积。目前在ELISA和时间荧光分辨检验技术中，其固相载体都是使用聚苯乙烯小杯状板条，这种固相载体的吸附表面是平整而光滑的，其反应的表面积和包被的表面积均十分有限，所以反应时间长，测量速度慢，线性范围窄，在被测物质浓度高时，易发生勾状效应而出现错误结果由于包被的固相载体又是反应杯，所以反应杯就决定了测定的项目，从而不利于流水线似的自动化定量分析。根据标记反应体系又可分为酶促和非酶促两种，酶促反应检测方式较简单，却存在工作曲线随时间漂移、低端斜率呈非线性下移等不足。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，提供一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法，该试剂盒采用化学发光免疫分析法定量检测血清/血浆中的游离三碘甲状腺原氨酸，具有操作简便、灵敏度高、检测快速、费用低廉、便于自动化等优点。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，包括以下试剂：固相试剂R1：含有T3类似物包被的顺磁性微球的悬液；液相试剂R2：含有吖啶酯标记的T3抗体的悬液；其中，R1中的顺磁性微球是表面包裹带有羧基活性基团的四氧化三铁，顺磁性微球的粒径大小为0.1～5μm。优选地，T3抗体为鼠单克隆游离T3抗体。上述固相试剂R1的制备方法为：A、顺磁性微球活化：取顺磁性微球，用pH6.0～8.0、10mM的磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中；采用浓度为0.5％～5％的EDC溶液活化，在30～40℃条件下，震荡混匀30～40分钟，得到顺磁性微球重悬液；B、包被抗原：将T3抗原类似物加入至顺磁性微球重悬液中，投料比为0.2％～2％，在25～37℃条件下反应2～3小时；再在25～37℃条件下封闭20～40分钟；将包被好的顺磁性微球用pH6.0～8.0，10mM磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中，得到含有浓度为0.05～0.5mg/ml的T3类似物包被的顺磁性微球的悬液。上述液相试剂R2的制备方法为：取T3抗体，用pH9.5，0.5M/L的磷酸缓冲液稀释至终浓度为20mg/ml，加入吖啶酯，标记比例为1:3，缓慢震荡，避光反应过夜；混合液经过葡聚糖凝胶G-25柱纯化后得到的含有浓度为1mg/ml的吖啶酯标记的T3抗体的悬液。上述游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，还包括校准品，所述校准品为含一定量T3抗原的去T3、T4人血清基质，其中低值校准品含T3抗原的浓度为1～2pg/ml，高值校准品含T3抗原的浓度为6～8pg/ml。上述游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，还包括质控品，所述质控品为含一定量T3抗原的的去T3、T4人血清基质，质控水平1的靶值范围为1～2pg/ml，质控品水平2的靶值范围为5～8pg/ml。上述游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，还包括酸性激发液和碱性激发液；酸性激发液由氧化氢和硝酸水溶液组成，其中过氧化氢的质量浓度在0.5％～5％之间，硝酸的摩尔浓度在1～10mM之间；碱性激发液由氢氧化钠水溶液组成，其中氢氧化钠的摩尔浓度在0.05～1M之间。上述游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，还包括清洗液，所述清洗液是含50g/L磷酸氢二钠、10g/L磷酸二氢钠、100g/LNaCl和2％表面活性剂的缓冲液。优选地，所述表面活性剂为Triton-100。本专利技术还提供了上述游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)固相试剂R1的制备A、顺磁性微球活化：取顺磁性微球，用pH6.0～8.0、10mM的磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中；采用浓度为0.5％～5％的EDC溶液活化，在30～40℃条件下，震荡混匀30～40分钟，得到顺磁性微球重悬液；B、包被抗原：将T3抗原类似物加入至顺磁性微球重悬液中，投料比为0.2％～2％，在25～37℃条件下反应2～3小时；再在25～37℃条件下封闭20～40分钟；将包被好的顺磁性微球用pH6.0～8.0，10mM磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中，得到含有浓度为0.05～0.5mg/ml的T3类似物包被的顺磁性微球的悬液；(2)液相试剂R2的制备取T3抗体，用pH9.5，0.5M/L的磷酸缓冲液稀释至终浓度为20mg/ml，加入吖啶酯，标记比例为1:3，缓慢震荡，避光反应过夜；混合液经过葡聚糖凝胶G-25柱纯化后得到的含有浓度为1mg/ml的吖啶酯标记的T3抗体的悬液。本专利技术还提供了上述游离三碘甲状腺原氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：固相试剂R1：含有T3类似物包被的顺磁性微球的悬液；液相试剂R2：含有吖啶酯标记的T3抗体的悬液；其中，R1中的顺磁性微球是表面包裹带有羧基活性基团的四氧化三铁，顺磁性微球的粒径大小为0.1～5μm。

【技术特征摘要】
1.一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：固相试剂R1：含有T3类似物包被的顺磁性微球的悬液；液相试剂R2：含有吖啶酯标记的T3抗体的悬液；其中，R1中的顺磁性微球是表面包裹带有羧基活性基团的四氧化三铁，顺磁性微球的粒径大小为0.1～5μm。2.根据权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，T3抗体为鼠单克隆游离T3抗体。3.根据权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，固相试剂R1的制备方法为：A、顺磁性微球活化：取顺磁性微球用pH6.0～8.0、10mM的磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中；采用浓度为0.5％～5％的EDC溶液活化，在30～40℃条件下，震荡混匀30～40分钟，得到顺磁性微球重悬液；B、包被抗原：将T3抗原类似物加入至顺磁性微球重悬液中，投料比为0.2％～2％，在25～37℃条件下反应2～3小时；再在25～37℃条件下封闭20～40分钟；将包被好的顺磁性微球用pH6.0～8.0，10mM磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中，得到含有浓度为0.05～0.5mg/ml的T3类似物包被的顺磁性微球的悬液。4.根据权利要求1或2所述的游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，液相试剂R2的制备方法为：取T3抗体，用pH9.5，0.5M/L的磷酸缓冲液稀释至终浓度为20mg/ml，加入吖啶酯，标记比例为1:3，缓慢震荡，避光反应过夜；混合液经过葡聚糖凝胶G-25柱纯化后得到的含有浓度为1mg/ml的吖啶酯标记的T3抗体的悬液。5.根据权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，还包括校准品，所述校准品为含一定量T3抗原的去T3、T4人血清基质，其中低值校准品含T3抗原的浓度为1～2pg/ml，高值校准品含T3抗原的浓度为6～8pg/ml。6.根据权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒，其特征在于，还包括质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘子菱，刘婷婷，何浩会，王香琪，阚洪晶，丛凡淏，付莉莉，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22