基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4试剂盒及制备和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒及制备和检测方法，该试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被；(2)荧光微球标记；(3)微流控芯片组装；(4)定标品的制备；(5)得基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒。制备得到的游离甲状腺素fT4试剂盒采用竞争法进行测定，选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗原的标记，利用免疫竞争反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。免疫反应后，使用清洗液将多余组分完全去除后，对免疫反应结合上的荧光微球进行检测读数，避免了引入显色液进入芯片内部反应不充分或者显色后读数不及时的问题。

Detection of free thyroxine fT4 kit based on microfluidic chip and its preparation and detection method

The invention discloses a free thyroxine fT4 kit based on microfluidic chip and a preparation and detection method. The preparation method of the kit comprises the following steps: (1) microfluidic chip coating; (2) fluorescent microsphere labeling; (3) microfluidic chip assembly; (4) preparation of calibration products; (5) preparation of free armor based on microfluidic chip. Adenosine fT4 kit. The free thyroxine fT4 kit was determined by competitive method. The highly sensitive time-resolved fluorescent substance was selected as the marker. The antigen was labeled on the fluorescent microspheres. Immune competitive reaction was used to analyze and detect the free thyroxine fT4 kit. The performance of the reagent was up to the level of the equivalent chemiluminescence reagent. After the immune reaction, the superfluous components were removed completely by the cleaning solution, and the fluorescent microspheres on the immune reaction were detected to avoid the problems of inadequate reaction or inappropriate reading after the introduction of the color reagent into the chip.

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4试剂盒及制备和检测方法
本专利技术属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4试剂盒及制备和检测方法。
技术介绍
微流控芯片技术是以微管道网络为结构特征，采用微加工技术在几平方厘米大小的芯片上刻蚀出微管道网络和其它功能单元，从而制备出包含进样、反应、分离、检测于一体的快速、高效、低耗的微型分析装置。微流控芯片在检测平台中具有试剂消耗少，反应时间短，自动化程度高的特点。在目前的研究中，芯片的微型化却给前期样品分离和配套集成带来不少困难，同时在样品固定，洗脱等方面也存在不少问题。微流控芯片检测主要有以下几点优势：1)器件微小且没有对人为操作，试剂消耗量很少；2)通过设计不同微流路实现在同一芯片中不同试剂的混合反应，减少繁琐的生物实验操作缩短检测所需时间；3)微流控芯片可与电路接合实现自动化控制；4)微流控芯片以及配套检测设备体积小巧，易于便携。游离甲状腺素(fT4)是一种由甲状腺合成并分泌的激素，也是构成甲状腺、脑垂体和下丘脑参与的负反馈机制的完整性不可缺少的成分。对合成代谢有影响作用，T4有两分子的二碘酪氨酸(DIT)在甲状腺内偶联生成。T4与甲状腺球蛋白结合储存在甲状腺滤泡的残腔中，在TSH的调节下分泌释放。在血清中99％以上的T4以与其他蛋白质结合的形式存在，其主要结合蛋白为甲状腺结合球蛋白(TBG)，次要结合蛋白为白蛋白和甲状腺结合前白蛋白(TBPA)。其余的甲状腺素未与运转蛋白发生结合，在循环系统中以游离形式存在。未结合的甲状腺素(或称为游离甲状腺素fT4)具有代谢活性，也是三碘甲状腺原氨酸(T3)的前体。游离甲状腺素的浓度与甲状腺素的分泌活性和代谢降解作用相关，在甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进的患者体内，其游离的甲状腺素浓度与总甲状腺素浓度同时发生变化。当由于甲状腺素结合蛋白(特别时甲状腺结合球蛋白)浓度变化而引起总甲状腺素浓度发生改变时，测定游离甲状腺素浓度具有重要临床意义。在健康个体内，甲状腺结合球蛋白(TBG)的浓度相对恒定，但是在某些条件下(如妊娠和接受甾类激素治疗)下，TBG的浓度可能发生变化，在上述条件下，游离甲状腺素的浓度未发生变化，但是总甲状腺素浓度会随着TBG的浓度变化而发生改变。在中国专利文献CN104614521A中公开了一种微流控芯片，包括柔性聚合物层和基片，柔性聚合物层和基片键合在一起，所述芯片中设有微沟道系统，所述微沟道系统包括缓冲液入口、样品入口、磁珠入口、废液出口、微阀、微泵区、磁珠塞区、循环区及检测区。上述技术方案采用灵敏度较低的比浊法，检测免疫磁珠和待测物之间的免疫反应所形成的络合物进行反应物前后的浊度变化，来进行判定待测物的浓度。相对而言，在采用免疫比浊这一方法学来说，由于不需要额外的配对抗体以及发光标记物，因此整体芯片结构设计较为简单。通过磁场在芯片沟道中形成的特定区域富集磁珠，样品持续通过此部分磁珠塞后与另一测磁珠结合，从而形成两个以上的磁珠团聚。采用其他现有技术或(1)芯片的结构过于复杂，无法对反应做出精确的调控，清洗步骤以及液体传导存在较大的污染；或(2)使用了多个液体腔室和固相载体(磁珠以及荧光微球同时使用)，试剂整体设计过于复杂；或(3)免疫反应采用了非均相反应，意为固相载体与固相载体的表面进行反应，反应不充分，灵敏度和重复性受到限制；或(4)未能选取灵敏度较高的荧光或者化学发光反应，而是采用了灵敏度较低的比浊反应或者层析反应，尤其是在采用层析体系的反应试剂，其层析试剂条抗体释放不完全这一根本问题以及单向反应的检测准确性不佳，导致检测结果受到影响。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗原的标记，利用免疫竞争反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平，免疫反应效率更高更充分的基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该基于微流控芯片检测游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被：取游离甲状腺素fT4鼠单抗Anti-Thyroxine6901SPTN-51mg，加50mMpH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25μL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；(2)荧光微球标记：取游离甲状腺素fT4抗原Thyroxine加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；定标品B组分：用定标品稀释液将甲状腺素T4抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；(5)得基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒。在本专利技术中，定标品稀释液主要为Tris-HCl的缓冲体系，浓度为50mM，pH8.5，包含牛血清、BSA、表面活性剂RPE1740、RPE2520以及叠氮钠；在所述步骤(3)中，稀释标记游离甲状腺素fT4鼠单抗Anti-Thyroxine6901SPTN-5微球，预先将微球水浴超声混匀，取20微升微球+80微升抽干保存液，混匀水浴超声，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入5uL的荧光微球溶液，于45℃真空烘箱中真空干燥30min，将处理好的芯片组装起来，超声键合，最后铝箔袋保存并加入干燥剂。在上述技术方案中，试剂基于微流控芯片作为载体，在微流控芯片内部的微流道反应器中进行免疫检测反应，单个芯片供单人份测试使用；制备得到的试剂盒进行检测，在手动加样后，仪器实现待测物在微流控芯片内的液体流动控制，免疫反应的调控以及反应结束后的清洗步骤，仪器通过收集荧光信号并计算出具体的反应值；当由于甲状腺素结合蛋白(特别时甲状腺结合球蛋白)浓度变化而引起总甲状腺素浓度发生改变时，测定游离甲状腺素浓度具有重要临床意义；在健康个体内，甲状腺结合球蛋白(TBG)的浓度相对恒定，但是在某些条件下(如妊娠和接受甾类激素治疗)下，TBG的浓度可能发生变化，在上述条件下，游离甲状腺素的浓度未发生变化，但是总甲状腺素浓度会随着TBG的浓度变化而发生改变。本专利技术技术方案制备得到的游离甲状腺素(fT4)试剂盒采用竞争法进行测定，患者血样中的fT4与一种fT4类似物竞争数量有限的，包被于芯片内部的fT4鼠单抗，上述fT4类似物预先标记在荧光微球上，并进行干燥处理。血样进入芯片内部后，溶解抽干后的微球，血样中fT4组分与标记有荧光微球的fT4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被：取游离甲状腺素fT4鼠单抗Anti‑Thyroxine 6901 SPTN‑5 1mg，加50mM pH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25μL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；(2)荧光微球标记：取游离甲状腺素fT4抗原Thyroxine加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2‑8℃保存；定标品B组分：用定标品稀释液将游离甲状腺素fT4抗原母液稀释至2ng/mL，2‑8℃保存；(5)得基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒。...

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被：取游离甲状腺素fT4鼠单抗Anti-Thyroxine6901SPTN-51mg，加50mMpH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25μL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；(2)荧光微球标记：取游离甲状腺素fT4抗原Thyroxine加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；定标品B组分：用定标品稀释液将游离甲状腺素fT4抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；(5)得基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒。2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取EDC使用Mes缓冲液配置成为10mg/mL的溶液，后使用Mes缓冲液进一步稀释成为1mg/mL的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固型物含量为10mg/mL，体积计算为100μL，置于EP管中，加入0.45mLMes缓冲液稀释，从1mg/mL的EDC活化剂溶液中取5μL迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的游离甲状腺素fT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述封闭液含有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞·陈，朱宗哲，
申请(专利权)人：南京岚煜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32