一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体的ELISA检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标反应板，100×浓缩酶标抗体、酶标抗体稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液、终止液、阳性对照样品和阴性对照样品。所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原由我国分离的3株口蹄疫A型代表毒株的优势抗原表位(TB/A)组成，因此提高了试剂盒检测的灵敏性和特异性，并且适用于不同的口蹄疫A型病毒感染的检测。本发明专利技术提供的试剂盒适于检测猪、牛、羊三种易感动物黏膜分泌物中的sIgA抗体，对于防治口蹄疫A型病毒的传播和感染具有重要的意义。

An ELISA Kit for Detection of Foot-and-Mouth Disease Type A Virus sIgA Antibody and Its Application

The invention discloses an ELISA detection kit for sIgA antibody of foot-and-mouth disease type A virus and its application. The kit comprises an enzyme-labeled reaction plate coated with a broad-spectrum multi-epitope recombinant antigen of foot-and-mouth disease virus type A, a 100 x concentrated enzyme-labeled antibody, an enzyme-labeled antibody dilution solution, a sample dilution solution, a concentrated detergent, a chromogenic solution, a terminating solution, a positive control sample and a negative control sample. The broad-spectrum multi-epitope recombinant antigen of foot-and-mouth disease type A virus is composed of three dominant antigen epitopes (TB/A) of representative strains of foot-and-mouth disease type A virus isolated in China, which improves the sensitivity and specificity of the kit and is suitable for the detection of different foot and mouth disease type A virus infections. The kit provided by the present invention is suitable for detecting sIgA antibodies in the mucosal secretions of three susceptible animals of pigs, cattle and sheep, and is of great significance for preventing and controlling the spread and infection of A virus.

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。本专利技术属于生物检测

技术介绍
口蹄疫(Foot-and-MouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒引起以患病动物的口、蹄部出现水疱性疾病为特征的传染性疾病。口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus,FMDV)属于小RNA病毒科，病毒中心是一条单链RNA。根据血清型特性可分为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型(即南非1、2、3型)和Asial(亚洲1型)7个血清型，不同血清型之间几乎没有免疫保护力，感染了一种血清型FMDV的动物仍可感染另一种血清型的FMDV而发病。FMDV感染对象多达70余种，潜伏期为1～7d，传播速度快，发病急，病毒主要通过呼吸道和消化道进入动物体内，首先进入动物喉部和扁桃体，然后进入动物血液循环系统，临床症状为感染动物精神不振，唾液酸，口、蹄、鼻和乳头区域出现水泡，在FMD潜伏期，几乎所有的组织、器官、分泌物、分泌物等都含有FMDV。该疾病是国际动物卫生组织(OIE)所指定的15种动物流行病名单的首位，对养殖业和国际动物贸易造成重大的经济损失。MDV基因组全长约8500个碱基，只含有一个大的开放阅读框，表达产生的聚蛋白逐级裂解产生病毒的结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，结构蛋白组装产生病毒的衣壳结构，非结构蛋白则参与病毒与宿主的相互作用、抑制宿主细胞的转录翻译机制、参与病毒的复制过程。病毒衣壳蛋白是诱导产生中和抗体的主要免疫原，在结构蛋白上存在多个构象性的与线性的中和表位。FMDV的四种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4中VP1的G-H环的氨基酸很容易变异，但其中的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp(RGD))高度保守。G-H环的跨度大约是VP1的140-160位的20个氨基酸残基。VP1蛋白上不仅存在主要的抗原位点(141-160aa，200-213aa和21-40aa)，而且含有FMD病毒的宿主识别位点。因此选择该区域基因构建表达载体表达纯化的蛋白可以作为良好的制备抗体检测试剂盒的备选包被抗原。另外通过原核表达系统制备的多表位抗原生产过程不涉及活病毒，不存在散毒的风险；既可随时根据流行毒株的变化调整表位序列，也可使用不同的抗原序列，增加抗原的广谱性。sIgA抗体作为黏膜免疫的主要效应因子，广泛存在于初乳、泪液、唾液等分泌液中，它不仅可以在第一时间中和病毒，而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应，进而阻止病毒的侵入。其主要功能有:阻抑黏附，免疫排除，溶解细菌，中和病毒，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC,antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)，抗炎症，促进天然因子作用及调节黏膜免疫反应。抗口蹄疫病毒sIgA抗体是口蹄疫病毒感染或者疫苗黏膜免疫后首先在呼吸道和消化道产生特异性的标志，同时也反应了黏膜免疫疫苗的效果。目前市场上还没有能够有效检测口蹄疫病毒sIgA抗体的试剂盒，鉴于近年来对黏膜免疫机制和黏膜免疫疫苗研究的深入，开发一种检测黏膜分泌物中口蹄疫病毒sIgA抗体水平的ELISA试剂盒，能够更加准确地反应口蹄疫病毒感染和黏膜免疫状态，同时利用该方法监测口蹄疫病毒sIgA抗体动态变化规律，为口蹄疫黏膜免疫疫苗和建立配套检测方法提供了理论与实验依据。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体的检测试剂盒及其方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术运用DNAStar软件对我国分离的3株口蹄疫病毒A型代表毒株(A/GDMM/2013，A/HuBWH/2009，A/GSLX/62)的VP1基因进行序列分析，确定了优势抗原表位，通过在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示的间隔子序列KKK、(G4S)2和GPGPG，从而构建得到多表位基因(TB/A)的串联序列，其串联顺序为A/GDMM/2013[(20-85)-KKK-(133-172)-(G4S)2-(193-212)]-GPGPG-A/HuBWH/2009[(20-85)-KKK-(133-172)-(G4S)2-(193-212)]-GPGPG-A/GSLX/62[(20-85)-KKK-(133-173)-(G4S)2-(194-213)]。多表位基因的核苷酸序列委托金斯瑞生物科技公司合成。本专利技术得到的一种口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包含口蹄疫A型病毒代表毒株A/GDMM/2013，A/HuBWH/2009，A/GSLX/62的VP1蛋白中的第20-85位、第133-172位以及第193-212位的主要中和性抗原表位序列，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。编码所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原的核苷酸序列也在本专利技术的保护范围之内，优选的，所述的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步的，本专利技术还提出了所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原在制备检测口蹄疫A型病毒sIgA抗体试剂中的用途。一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板、100×浓缩酶标抗体、酶标抗体稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液、终止液、阳性对照样品和阴性对照样品。其中，优选的，所述口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原是经原核表达系统表达获得。其中，优选的，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板按照以下方法制备得到：(1)包被抗原的制备和包被原核表达系统表达获得的重组蛋白包涵体经复性及Ni-NTA纯化得到口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，包被时用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/ml，按照100μl/孔包被酶标板，4℃冰箱静置过夜；(2)酶标板的封闭与保存包被过夜的酶标板用PBST洗涤4次拍干，每孔加100μl含0.5w/v％BSA的10mMPBS封闭液，37℃放置2h，弃掉封闭液，PBST洗涤3遍，得到预包被抗原的酶标板，每孔加100μl含6v/v％马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，用铝箔袋真空封口，4℃保存；其中，所述的酶标板稳定剂是将5gBSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/LPBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用。其中，优选的，所述阳性对照样品是采集口蹄疫A型病毒攻毒后7-21d猪、牛以及羊的鼻拭子样品，经混合、一系列稀释后检测OD450值为1.5±0.05的样品；所述阴性样品是FMDVNS试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，口蹄疫A型、O型、AsiaI液相阻断ELISA试剂盒检测血清抗体效价<1/4，FMDV特异性PCR检测抗原为阴性的猪、牛以及羊的鼻拭子，经混合、稀释后检测OD450本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原，其特征在于，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包含口蹄疫A型病毒代表毒株A/GDMM/2013，A/HuBWH/2009，A/GSLX/62的VP1蛋白中的第20‑85位、第133‑172位以及第193‑212位的主要中和性抗原表位序列，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原，其特征在于，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包含口蹄疫A型病毒代表毒株A/GDMM/2013，A/HuBWH/2009，A/GSLX/62的VP1蛋白中的第20-85位、第133-172位以及第193-212位的主要中和性抗原表位序列，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.编码权利要求1所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求1所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原在制备检测口蹄疫A型病毒sIgA抗体试剂中的用途。4.一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板、100×浓缩酶标抗体、酶标抗体稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液、终止液、阳性对照样品和阴性对照样品。5.如权利要求4所述的口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原是经原核表达系统表达获得。6.如权利要求4所述的口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原包被的酶标板按照以下方法制备得到：(1)包被抗原的制备和包被原核表达系统表达获得的重组蛋白包涵体经复性及Ni-NTA纯化得到口蹄疫A型病毒广谱多表位重组抗原，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，包被时用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/ml，按照100μl/孔包被酶标板，4℃冰箱静置过夜；(2)酶标板的封闭与保存包被过夜的酶标板用PBST洗涤4次拍干，每孔加100μl含0.5w/v％BSA的10mMPBS封闭液，37℃放置2h，弃掉封闭液，PBST洗涤3遍，得到预包被抗原的酶标板，每孔加100μl含6v/v％马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，用铝箔袋真空封口，4℃保存；其中，所述的酶标板稳定剂是将5gBSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/LPBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用。7.如权利要求4所述的口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照样品是采集口蹄疫A型病毒攻毒后7-21d猪、牛以及羊的鼻拭子样品，经混合、一系列稀释后检测OD450值为1....

【专利技术属性】
技术研发人员：潘丽，张中旺，吕建亮，罗虹，王永录，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62