雄激素受体剪接突变体AR-V7的免疫荧光检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种雄激素受体剪接突变体AR‑V7的免疫荧光检测试剂盒及应用，本发明专利技术所述方法，检测原理如下：首先富集非体液性稀有有核细胞，然后根据抗原抗体反应原理，采用免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白在细胞中的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的非体液性稀有有核细胞进行判读和计数。

Immunofluorescence Detection Kit for Androgen Receptor Spliced Mutant AR-V7 and Its Application

The present invention relates to an immunofluorescence detection kit for androgen receptor splicing mutant AR_V7 and its application. The detection principle of the method is as follows: firstly, non-humoral rare nuclear cells are enriched, and then, according to the principle of antigen-antibody reaction, the expression of target protein in enriched cells is detected by immunofluorescence detection method. In this kit, target cells and common antigen CD45 of leukocytes were labeled by fluorescence, and target protein-positive and CD45-negative cells were screened to read and count specific protein-positive non-humoral rare nuclear cells.

【技术实现步骤摘要】
雄激素受体剪接突变体AR-V7的免疫荧光检测试剂盒及应用
：本专利技术涉及一种医用检测方法，特别涉及体液中的肿瘤细胞的检测，具体涉及人雄激素受体剪接突变体AR-V7免疫荧光检测试剂盒。适用于不同类型样本雄激素受体剪接突变体AR-V7检测，还涉及该试剂盒在检测雄激素受体剪接突变体AR-V7中的用途。
技术介绍
：前列腺癌指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，被列为全球造成男性死亡的五大癌症之一。目前治疗前列腺癌的重要手段是雄激素剥夺治疗，即使用某些特异性的抑制剂阻断雄激素受体及其信号通路，从而延长患者存活。然而，多数患者在治疗后两年内会发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostatecancer，CRPC)，预后较差。AR-Vs(androgenreceptorsplicevariants，AR-Vs)是指在雄激素受体mRNA的异常剪接或基因重组过程中产生的、在没有雄激素的情况下仍能促进靶基因转录的剪接突变体。在去势抵抗性前列腺癌患者中，AR-Vs的出现，使得患者对抗前列腺癌药物产生耐药性，增加治愈难度。研究显示，AR-V7是目前已知的表达最为广泛的剪接突变体。TAXYNERGY研究(AntonarakisES，etal.JClinOncol.2017)显示，在AR-V7阳性特别是定位于细胞核的阳性患者中，紫杉烷化疗比靶向雄激素受体的药物(enzalutamide或abiraterone)治疗更加有效；而在AR-V7阴性患者中，对靶向雄激素受体的药物enzalutamide和abiraterone的治疗更加敏感(AntonarakisES，etal.NEnglJMed.2014)。目前临床对肿瘤治疗的监测主要依赖于病理学、影像学和血清学三种方法。病理学是肿瘤诊断的金标准，但是组织取样具有一定的创伤性，且受限于取材部位，同时由于肿瘤组织的异质性，单点组织取样不足以反应整体肿瘤状态，且难以重复取样动态监测。影像学方法应用较广泛，但是影像学一般存在辐射伤害。而且，影像学通常只反应肿瘤大小等信息，难以判断肿瘤的恶性程度。更重要的一点，影像学通常只能检测2mm以上的肿瘤组织，对于较小的肿瘤组织诊断敏感性较差，存在滞后性。血清学检测取样较为方便，但是灵敏度和特异性较差，且与病理生理相关性差。同样的，在治疗方面，目前临床上也存在一定的局限性。对于肿瘤患者，特别是发生转移的患者，目前通常只依据原发灶的信息来判断治疗方案，忽略了对转移灶甚至微转移灶的检测与治疗。治疗过程中通过影像学或血清学来判断治疗疗效，在疗效判断的精准性等方面存在一定的局限。目前针对AR-V7的检测多在患者组织样本或外周血样中，利用PCR方法对其mRNA水平进行测定(AntonarakisES，etal.NEnglJMed.2014；SeitzAK，etal.EurUrol.2017)，然而部分研究(TakeuchiT，etal.ResRepUrol，2016)发现：在正常造血细胞中亦能检测到AR-V7的mRNA，因此AR-V7mRNA水平的变化与患者的药物反应并不完全一致。组织中AR-V7的免疫组化检测是在不同组织切片上进行的，然而由于肿瘤细胞异质性的原因，单张片子上AR-V7并不能反映患者整体的AR-V7表达水平。因此需要一种新的方法对与疾病复发、转移相关的肿瘤细胞的AR-V7表达水平进行检测，用于预测特定药物对患者的治疗作用，为疾病治疗方案的选择提供参考。以循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)为主的体液肿瘤细胞的检测可为上述局限性提供一些解决方案。CTC是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，CTC的检出提示体内原发灶或转移灶的存在，或癌前病变细胞的存在，是转移病灶形成的“种子”细胞，是肿瘤发生发展的直接证据。近年来不断有证据显示：在肿瘤发生发展的早期，甚至是影像学可见病灶形成之前肿瘤就播散入血了，这种播散可能存在于肿瘤发展的整个过程中。所以，对CTC进行检测有利于早期发现肿瘤、辅助诊断或为选择治疗方案提供参考。同时，对CTC进行动态检测可了解患者对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号。体液性有核细胞指生物体液内含有的有核细胞，也包括这些细胞在病理情况下的渗出或漏出，如血液、炎性渗出液中的各种白细胞；非体液性稀有有核细胞是指体液内出现的非正常的稀有有核细胞，包含CTC、循环肿瘤干细胞(circulatingtumorcell，CSC)，胸/腹腔积液、灌洗液、心包积液、脑脊液、尿液、引流液、痰液、前列腺液、精液、骨髓、脐带血、羊水等来源的肿瘤细胞，以及血中的胎儿细胞。对非体液性稀有有核细胞进行检测，可为患者诊断、治疗提供更全面的信息。专利技术目的：本专利技术中的试剂盒可检测前列腺癌非体液性稀有有核细胞中AR-V7的表达水平来对前列腺癌患者的用药提供参考性的意见。通过针对AR-V7的特异性抗体来对患者非体液性稀有有核细胞进行分型，通过对AR-V7阳性细胞的数量和其AR-V7的表达水平、细胞内定位来对前列腺癌的用药提供参考性的意见。目前肿瘤患者的病理检测，主要是进行组织学检测，面临着反复取样困难，不能动态监测，单个组织样本不足以反映整体肿瘤负荷等不足，不能实时有效的反映进入体液的非体液性稀有有核细胞变化。本专利技术中通过免疫荧光染色对患者的非体液性稀有有核细胞中AR-V7的蛋白表达水平进行检测，实时监测其动态变化，可以更精准的反映患者的疾病负荷。从而为采取不同的治疗方案提供更多的依据。本专利技术在对非体液性稀有有核细胞计数的基础上可同时对此类细胞中AR-V7的蛋白表达水平进行检测，并分析AR-V7的细胞定位。本专利技术可对包括组织、血液、细胞系、积液、灌洗液、前列腺液、尿液、引流液等来源的非体液性稀有有核细胞进行检测。
技术实现思路
：针对现有技术的不足，本专利技术提供一种检测人雄激素受体剪接突变体AR-V7的方法及其试剂盒。现有技术尚无采用免疫荧光方法检测非体液性稀有有核细胞中AR-V7表达的报道。本专利技术所述方法，检测原理如下：首先采用已知的方法富集非体液性稀有有核细胞，其中所述富集方法可以采用中国专利200810097889.4、201310057307.0、2015104411229中描述的方法。然后根据抗原抗体反应原理，采用已知的免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白在细胞中的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的非体液性稀有有核细胞进行判读和计数。在此基础上，将靶蛋白阳性、CD45阴性的候选非体液性稀有有核细胞按照目的蛋白荧光强度将其表达按照高、中、低表达进行分类。但将免疫荧光检测方法用于检测非体液性稀有有核细胞中AR-V7表达在实践中遇到诸多困难，包括：细胞容易从玻片脱落、荧光较弱、非特异染色、基质背景高等。本专利技术经过多次筛选研究，最终得到一种适合的方法，解决了上述困难，同时在实践过程中，意外的发现，本专利技术的检测结果和现有技术相比检测精度和准确率大大提高。本专利技术的检测方法，步骤如下：2)稀有有核细胞的富集取血液和其他体液样品，对其中的非体液性稀有有核细胞可进行富集，其中所述富集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测非体液性稀有有核细胞中AR‑V7表达的方法，所述方法，步骤如下：1)稀有有核细胞的富集取血液和其他体液样品，对其中的非体液性稀有有核细胞进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD‑G液，2)将富集的稀有有核细胞进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的AR‑V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；2.4)避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，2.6)复染：取10μL DAPI染液，加至标本区，2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或‑20℃环境下避光保存，3)对样本进行镜检观察将标本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，4)结果判断阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，同时记录阳性信号的细胞定位，阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种检测非体液性稀有有核细胞中AR-V7表达的方法，所述方法，步骤如下：1)稀有有核细胞的富集取血液和其他体液样品，对其中的非体液性稀有有核细胞进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD-G液，2)将富集的稀有有核细胞进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的AR-V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；2.4)避光，取CYP2100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，2.6)复染：取10μLDAPI染液，加至标本区，2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或-20℃环境下避光保存，3)对样本进行镜检观察将标本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，4)结果判断阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，同时记录阳性信号的细胞定位，阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭素杰，郭志敏，樊晓婷，
申请(专利权)人：北京莱尔生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11