杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学及兽用生物制品技术领域，旨在提供一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗，该疫苗是通过杆状病毒表达系统表达的含有信号肽的猪瘟SP‑E2蛋白，其中信号肽SP的序列如SEQ ID NO.1所示，表达E2蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术研制的SP‑E2亚单位疫苗免疫小鼠后能够优先于其QZ14‑E2、HZ08‑E2蛋白的产生猪瘟的特异性抗体，且中和抗体水平远高于QZ14‑E2、HZ08‑E2蛋白；免疫猪后可诱导产生特异性抗体。本发明专利技术的疫苗具有产量高，免疫原性强，安全性好，通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能够从根本上净化猪瘟病毒。

【技术实现步骤摘要】
杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法及应用
本专利技术属于分子生物学及兽用生物制品
，具体涉及杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
猪瘟(Classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征，主要危害家猪和野猪，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟的流行趋势发生了很大变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，且免疫失败的现象时有发生。这种新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。目前，疫苗接种仍然是防制猪瘟的重要措施，但是传统疫苗由于是弱毒疫苗，不能区分感染和免疫动物(DifferentiatingInfectedfromVaccinatedAnimals，DIVA)，因而不能满足防制猪瘟的需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供了一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法及应用。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗，是通过杆状病毒表达系统表达的含有信号肽的猪瘟SP-E2蛋白，其中信号肽SP的序列如SEQIDNO.1所示，表达E2蛋白的核酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述的猪瘟E2亚单位疫苗的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术进一步提供了所述猪瘟E2亚单位疫苗在防治猪瘟病毒感染中的应用。本专利技术所述猪瘟SP-E2亚单位疫苗的制备方法，包括步骤如下：1)构建含有E2及其信号肽目的基因的穿梭质粒，将其转化DH10Bac感受态细胞，使其发生转座，通过蓝白斑筛选，获得重组杆粒；2)将重组杆粒转染昆虫细胞，获得杆状病毒，并将杆状病毒在昆虫细胞上进行传代；3)将P3代病毒液感染大量的昆虫细胞，纯化并获取E2蛋白；4)利用SP-E2蛋白与seppic206水佐剂充分乳化，制得猪瘟SP-E2亚单位疫苗。进一步地，该方法的具体操作步骤如下所述：(1)目的基因的扩增根据Genbank设计引物SP-F、SP-R、E2-F和E2-R；先以引物SP-F、SP-R扩增获得SP信号肽，以引物E2-F、E2-R扩增获得E2片段，再以SP信号肽、E2蛋白为模板，引物SP-F、E2-R扩增获得目的基因SP-E2；引物SP-F、SP-R、E2-F和E2-R的序列如SEQIDNO.4～7所示；(2)穿梭质粒的构建pFastBacHTB质粒以EcoRⅠ和XholⅠ限制性内切酶37℃酶切2h后回收，将酶切的载体与目的基因用同源重组酶37℃重组30min，转化Ecoli感受态细胞，挑斑鉴定，阳性菌送测序；(3)重组杆粒的获取将阳性质粒转化DH10Bac感受态细胞，48h后挑选白斑，用引物M13-F和M13-R进行PCR鉴定后抽提杆粒；引物M13-F和M13-R的序列如SEQIDNO.8～9所示；(4)转染及杆状病毒的获取用脂质体转染试剂ⅡReagent按照Invitrogen说明书进行转染SF9细胞，27℃培养96h，细胞出现病变，收集P1代病毒液，将P1代病毒液重新感染HighFive细胞，27℃培养96h后收获P2代病毒液，同样的方法获取P3代病毒液；(5)SP-E2的Westernblot鉴定将P1代毒液加入长至70％-80％密度的HighFive细胞的96孔板，27℃感染96h后进行Westernblot鉴定，一抗为CSFV的阳性血清、阴性血清及单抗，二抗为HRP标记的兔抗猪二抗、FITC标记的羊抗鼠二抗；(6)SP-E2的IFA鉴定将P1代毒液加入长至70％-80％密度的HighFive细胞的96孔板，27℃感染48h后进行间接免疫荧光实验，一抗为CSFV的阳性血清、阴性血清及单抗，二抗为FITC标记的兔抗猪二抗、FITC标记的羊抗鼠二抗；(7)蛋白的表达及纯化用50ml培养基在250ml摇瓶里培养HighFive细胞，当细胞密度到达1.5×106个/ml时，以MOI＝1感染细胞，27℃，115rpm/h培养96h，4000rpm离心10min，收集上清，用镍柱纯化蛋白，将纯化的蛋白进行定量及WesternBlot鉴定。专利技术原理描述：猪瘟病毒为黄病毒科瘟病毒属成员，含有一个大的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，该阅读框编码一个含3898个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，加工形成4个结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中囊膜糖蛋白E2是主要保护性抗原蛋白，可以诱导抗猪瘟的保护性免疫。杆状病毒表达系统在近年来迅速发展，由于其操作简单、安全性高、可通过悬浮培养规模表达蛋白、有翻译后修饰作用、其蛋白的免疫原性及构想与天然蛋白相似等优点而得到广泛的应用。利用杆状病毒表达系统制备猪瘟E2亚单位疫苗免疫原性强，安全性好，通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能从根本上净化猪瘟病毒。由于杆状病毒表达系统表达不同的猪瘟E2蛋白，其表达产量、免疫效果等方面有较大差异，导致杆状病毒表达系统表达的猪瘟E2亚单位疫苗还未普及与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术研制的SP-E2亚单位疫苗免疫小鼠后能够优先于其QZ14-E2、HZ08-E2蛋白的产生猪瘟的特异性抗体，且中和抗体水平远高于QZ14-E2、HZ08-E2蛋白；免疫猪后可诱导产生特异性抗体。2、本专利技术的疫苗具有产量高，免疫原性强，安全性好，通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能够从根本上净化猪瘟病毒。附图说明图1为SP-E2重组杆状病毒构建示意图。图2为目的基因PCR扩增及重组杆粒的PCR鉴定图(左图为目的基因的扩增图，右图为重组杆粒的PCR的鉴定图)。图3为SP-E2蛋白在昆虫细胞中的表达结果(左图为SDS-PAGE结果，右图为Westernblot图)。图4为SP-E2蛋白在昆虫细胞中的IFA鉴定结果(Sf9细胞感染Bac-SP-E248h后，用猪瘟标准阳性血清、标准阴性血清，单抗IFA鉴定SP-E2在昆虫细胞的表达情况)。图5为SP-E2、E2、CSP-CE2、SP-CE2、CSP-E2蛋白纯化鉴定结果(左图为蛋白10倍浓缩图，右图为蛋白2倍浓缩图)。图6为小鼠免疫SP-E2亚单位疫苗0、7、14、21、28天的血清的中和效价、ELISA及IFA结果。(图中A为血清的ELISA结果，B为血清的中和效价，C为免疫7天的血清的IFA结果，D为免疫14天的血清的IFA结果)图7为猪免疫SP-E2亚单位疫苗0、7、14、21、28天的血清阻断ELISA结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，而不意图限制本专利技术的范围。本专利技术蛋白的表达过程中所用引物的序列如下表所示：实施例1猪瘟SP-E2蛋白的表达1)目的基因的扩增根据Genbank设计引物SP-F、SP-R、E2-F、E2-R，先以SP-F、SP-R扩增获得SP信号肽，以E2-F、E2-R扩增获得E2片段，再以SP、E2为模板，SP-F、E2-R引物扩增获得目的基因SP-E2(如图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗是通过杆状病毒表达系统表达的含有信号肽的猪瘟SP‑E2蛋白，其中信号肽SP的序列如SEQ ID NO.1所示，表达E2蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗是通过杆状病毒表达系统表达的含有信号肽的猪瘟SP-E2蛋白，其中信号肽SP的序列如SEQIDNO.1所示，表达E2蛋白的核酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的猪瘟E2亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.权利要求1所述猪瘟E2亚单位疫苗在防治猪瘟病毒感染中的应用。4.权利要求1所述的猪瘟SP-E2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：1)构建含有E2及其信号肽目的基因的穿梭质粒，将其转化DH10Bac感受态细胞，使其发生转座，通过蓝白斑筛选，获得重组杆粒；2)将重组杆粒转染昆虫细胞，获得杆状病毒，并将杆状病毒在昆虫细胞上进行传代；3)将P3代病毒液感染大量的昆虫细胞，纯化并获取E2蛋白；4)利用SP-E2蛋白与seppic206水佐剂充分乳化，制得猪瘟SP-E2亚单位疫苗。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法的具体操作步骤如下所述：(1)目的基因的扩增根据Genbank设计引物SP-F、SP-R、E2-F和E2-R；先以引物SP-F、SP-R扩增获得SP信号肽，以引物E2-F、E2-R扩增获得E2片段，再以SP信号肽、E2蛋白为模板，引物SP-F、E2-R扩增获得目的基因SP-E2；引物SP-F、SP-R、E2-F和E2-R的序列如SEQIDNO.4～7所示；(2)穿梭质粒的构建pFastBacHTB质粒以EcoRⅠ和XholⅠ限制性内切酶37℃酶切2h后回收，将酶切的载体与目的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐慧玲，何放，方维焕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33