重组蛋白在粉纹夜蛾蛹中的表达制造技术

本发明专利技术包括提高重组蛋白表达效率的手段和方法，特别地优化在昆虫蛹中，特别地在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,T.Ni)蛹中重组蛋白的工业化生产。此外，本发明专利技术还涉及包含杆状病毒的蛹本身，用杆状病毒或杆粒感染、转化、转导或转染的蛹，以及适合于执行本发明专利技术的方法的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组蛋白在粉纹夜蛾蛹中的表达专利技术的领域本专利技术可包括在生物
中，并且其包括提高重组蛋白表达效率的手段和方法，特别在昆虫蛹中，特别地在粉纹夜蛾(Trichoplusiani,T.ni)蛹中重组蛋白的工业化生产，包括其优化。此外，本专利技术还涉及包含杆状病毒的蛹本身，用杆状病毒或杆粒感染、转化、转导或转染的蛹。现有技术杆状病毒表达载体系统(BEVS)是一种用于生产重组蛋白，例如，被用作疫苗、治疗分子或诊断试剂的蛋白的得到确认的方法。由于其过表达和快速发展的潜力，BEVS是用于生产任何目的的重组蛋白的最具吸引力的选择之一。在工业上用于重组蛋白表达的使用最好的杆状病毒载体基于以草地贪夜蛾9(Sf9)或21(Sf21)昆虫细胞作为合适的表达宿主的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)，(Nettleship,J.E.,Assenberg,R.,Diprose,J.M.,Rahman-Huq,N.,Owens,R.J.Recentadvancesintheproductionofproteinsininsectandmammaliancellsforstructuralbiology.J.Struct.Biol.2010,172,55–65)，以及粉纹夜蛾(T.ni)昆虫幼体作为活生物工厂(Gomez-CasadoE,Gomez-SebastianS,MC,Lasa-CovarrubiasR,Martínez-PulgarínS,EscribanoJM.Insectlarvaebiofactoriesasaplatformforinfluenzavaccineproduction.ProteinExprPurif.79:35-43.2011)。由于BEVS是在80年代开发的(Smith,G.E.,M.D.Summers,andM.J.Fraser.1983.Productionofhumanbetainterferonininsectcellsinfectedwithabaculovirusexpressionvector.Mol.Cell.Biol.3:2156-2165)，已在杆状病毒感染的昆虫细胞中成功地生产了数百种从胞质酶到膜结合蛋白的重组蛋白。最近，已描述了新的杆状病毒载体。例如，WO2012/168493和WO2012168492描述了用于在昆虫和昆虫细胞中表达重组蛋白的重组DNA元件。全世界，在将低价值基质桑树的叶子转化成高价值的基于蛋白质的产品：蚕丝的过程中每年生产了约70,000吨蚕丝。由于它们加速的代谢，昆虫是非常有效的蛋白制造者。鳞翅目例如家蚕(B.mori，桑蚕)或粉纹夜蛾(拟尺蠖(cabbagelooper))是两种在生物技术中最常使用的昆虫。在不到2周内，它们在尺寸上生长约5000倍且每只家蚕昆虫生产长于一千米的蚕丝。虽然来自丝腺的细胞可成产约80μg蛋白/细胞/天，最好的哺乳动物细胞培养系统生产仅约50pg蛋白/细胞/天。因此，由于生产多功能化、可扩展性、自动化可能性、效率和发展速度，昆虫作为活生物工厂，构成昆虫细胞、常规发酵技术和植物衍生蛋白的有前途的替换物，并且。例如，昆虫作为活生物工厂避免了在例如昆虫细胞中用于表达蛋白质的生物反应器的必要性。由于它们效率低、昂贵、技术上的复杂性(其花费多年去构建，难于验证、需要质量的个人去它们的操作，它们很容易污染并且是不可靠的)，生物反应器是生产新的和现有的重组蛋白的技术和经济障碍。此外，它们面临有限的可扩展性的问题。家蚕的幼虫已经被广泛地用作使用杆状病毒表达载体系统表达重组蛋白的活生物工厂(Wang,DN；Liu,JW；Yang,GZ；Zhang,WJ；Wu,XF.2002.Cloningofanti-LPSfactorcDNAfromTachypleustridentatus,expressioninBombyxmorilarvaeanditsbiologicalactivityinvitro.MolecularBiotechnology,21(1),1-7；Wu,XF；Kamei,K；Sato,H；Sato,S；Takano,R；Ichida,M；Mori,H；Hara,S.2001.High-levelexpressionofhumanacidicfibroblastgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorinsilkworm(BombyxmoriL.)usingrecombinantbaculovirus.ProteinExpressionAndPurification,21(1),192-200；Kulakosky,PC；Hughes,PR；Wood,HA.1998.N-linkedglycosylationofabaculovirus-expressedrecombinantglycoproteinininsectlarvaeandtissueculturecells.Glycobiology,8(7),741-745；Suzuki,T；Kanaya,T；Okazaki,H；Ogawa,K；Usami,A；Watanabe,H；KadonoOkuda,K；Yamakawa,M；Sato,H；Mori,H；Takahashi,S；Oda,K.1997.EfficientproteinproductionusingaBombyxmorinuclearpolyhedrosisviruslackingthecysteineproteinasegene.JournalOfGeneralVirology,78,3073-3080；Sumathy,S；Palhan,VB；Gopinathan,KP.1996.ExpressionofhumangrowthhormoneinsilkwormlarvaethroughrecombinantBombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus.ProteinExpressionAndPurification,7(3),262-268；U.Reis,B.Blum,B.U.vonSpecht,H.Domdey,J.Collins,AntibodyproductioninsilkwormcellsandsilkwormlarvaeinfectedwithadualrecombinantBombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,Biotechnology(NY)10(1992)910–912)。粉纹夜蛾的幼虫也已经被用于重组蛋白的表达(Perez-Martin,E.,Gomez-Sebastian,S.,Argilaguet,J.M.,Sibila,M.,Fort,M.,Nofrarias,M.,Kurtz,S.,Escribano,J.M.,Segales,J.,Rodriguez,F.,2010.ImmunityconferredbyanexperimentalvaccinebasedontherecombinantPCV2CapproteinexpressedinTrichoplusiani-l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒和/或杆粒的蛹，其中所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属或棉铃虫属。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.17 EP 15382451.11.一种包含来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒和/或杆粒的蛹，其中所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属或棉铃虫属。2.根据权利要求1所述的蛹，其特征在于，所述重组杆状病毒和/或杆粒包含编码重组蛋白的核酸序列，其中所述重组蛋白优选地选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂和绿色荧光蛋白(GFP)的组，和/或其中所述重组蛋白优选地不是由蛹内源性产生的蛋白。3.根据权利要求1或2中任一项所述的蛹，其特征在于，所述杆状病毒和/或杆粒包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)，其中允许蛋白IE-1、IE-0和/或其片段表达的核酸序列选自包含如下的组：(a)包含在SEQIDNO:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；(b)具有与SEQIDNO:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；(c)编码包含在SEQIDNO:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及(d)编码具有与SEQIDNO:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地少95％序列相似性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。4.一种包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)的蛹，其中所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属或棉铃虫属，优选地属于粉纹夜蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、谷实夜蛾种、烟芽夜蛾种或尺蠖种，其中允许蛋白IE-1、IE-0和/或其片段表达的核酸序列选自包含如下的组：(a)包含在SEQIDNO:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；(b)具有与SEQIDNO:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；(c)编码包含在SEQIDNO:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及(d)编码具有与SEQIDNO:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地少95％序列相似性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。5.根据权利要求2-4中任一项所述的蛹，其特征在于，驱动所述重组蛋白的表达的启动子为选自由如下核酸组成的组：(a)包含在SEQIDNO:10-14中任一条所示的，优选地在SEQIDNO:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与SEQIDNO:10-14中任一条所示的，优选地与SEQIDNO:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列；和/或其中重组同源区(hr)是由SEQIDNO:21(hr1)所示的序列。6.根据权利要求2-5中任一项所述的蛹，其特征在于，包含重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的组合的核酸序列选自由SEQIDNO:15-20组成的组。7.根据权利要求3-6中任一项所述的蛹，其特征在于，所述蛹进一步包含编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白优选地选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂和绿色荧光蛋白(GFP)的组。8.如权利要求1-7中任一项所定义的蛹用于表达重组蛋白的用途，所述重组蛋白优选地选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因...

【专利技术属性】
技术研发人员：何塞·安赫尔·马丁内斯·埃斯克里瓦诺，卡门·阿尔瓦拉多·弗拉多，埃德尔·雷伊托尔·萨维德拉，米格尔·西德费尔南德斯，
申请(专利权)人：替代基因公司，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES