一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测领域，具体公开了一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT‑PCR检测引物及应用，发明专利技术人首次从患病黄鳝幼苗中分离出了一种黄鳝弹状病毒，该病毒为黄鳝弹状病毒（Chinese rice‑field eel rhabdovirus）CrERV，保藏编号为：CCTCC NO：V201819，对于黄鳝弹状病毒的研究具备开拓性的意义。针对该病毒序列设计引物，可对黄鳝弹状病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用
本专利技术属于病毒分子检测
，具体涉及一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用。技术背景弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒是一类具有广泛宿主的负链RNA病毒，其颗粒呈现子弹状或棒状。其中狂犬病病毒(Rabiesvirus)最为人熟知，能引起人或其他温血动物的狂犬病，病死率几乎为100％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对养殖宠物安全度的恐慌。因此，对弹状病毒进行深入研究具有重要意义。此外，弹状病毒还能引起家畜多种急性传染病(如牛流行热，ephemeralfever)，以及鱼类和多种农作物的感染性疾病。国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)于2017年发表了最新的病毒分类第十次报告，将弹状病毒科(Rhabdoviridae)划分为18个属，其中能够感染鱼类的弹状病毒有Perhabdovirus,Sprivivirus和Novirhabdovirus三个属。目前以上三个属能够感染多种养殖鱼类，具有强烈的致病性，死亡率可以达到100％，给全球的海淡水养殖业造成重大的经济损失，尤其根据《进出口活水生动物检验检疫协议》，进出境的养殖鱼类，例如鲈鱼、鲤鱼、虹鳟、鲫鱼、牙鲆等养殖和种苗用鱼种，均要进行弹状病毒(IHNV、SVCV、HIRRV)疫病检测，口岸安全意义重大，影响进出口经济贸易。目前对感染鱼类弹状病毒科的研究主要集中在Sprivivirus和Novirhabdovirus两个属，而Perhabdovirus属作为2017年弹状病毒科新命名的一个属，对其研究甚少。目前该属中包括鳜鱼弹状病毒，该病毒能够引起鳜鱼大量死亡。目前，黄鳝弹状病毒(Chineserice-fieldeelrhabdovirus，CrERV)全长序列尚无公开报道，更也无有效的检测方法。本申请首次从染病的黄鳝中分离得到黄鳝弹状病毒(Chineserice-fieldeelrhabdovirus，CrERV)，针对鳜鱼弹状病毒和黄鳝弹状病毒在P基因结构的区别设计特异性引物，建立RT-PCR检测方法不仅用于检测和监测养殖黄鳝的健康状况，而且通过序列比对能够区别黄鳝弹状病毒和鳜鱼弹状病毒。为黄鳝和鳜鱼养殖及早病原检测和监测提供保障。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种黄鳝弹状病毒CrERV，所述的病毒分离自黄鳝病变细胞，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黄鳝弹状病毒(Chineserice-fieldeelrhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCCNO：V201819，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了黄鳝弹状病毒CrERV的基因，所述基因为SEQIDNO.1所示。本专利技术还有一个目的在于提供一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'。本专利技术还有一个目的在于提供了黄鳝弹状病毒CrERV的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成黄鳝弹状病毒病疫苗，或是制备成黄鳝弹状病毒的实验室对照品。本专利技术的最后一个目的在于提供一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的引物制备成黄鳝弹状病毒检测试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种黄鳝弹状病毒CrERV，所述的病毒分离自黄鳝病变细胞，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黄鳝弹状病毒(Chineserice-fieldeelrhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCCNO：V201819，地址：中国武汉武汉大学。将黄鳝弹状病毒CrERV接种到鲫脑细胞系(GibelCarpBrain,GiCB)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GiCB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。培养基：M199，10％胎牛血清，pH7.0～7.2。黄鳝弹状病毒CrERV的形态特征：病毒呈子弹状或梭形，病毒具有双层脂质囊膜，与典型的弹状病毒形态相符。黄鳝弹状病毒CrERV的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成黄鳝弹状病毒病疫苗，或是制备成黄鳝弹状病毒的实验室对照品。本专利技术的保护内容还包括基于黄鳝弹状病毒CrERV的全序列(SEQIDNO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物可用于检测黄鳝弹状病毒CrERV。一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物，包括F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'。一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于检测黄鳝弹状病毒检测试剂盒，或直接用于黄鳝弹状病毒的检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术首次自黄鳝中分离并克隆了弹状病毒的全长序列，对于黄鳝弹状病毒的研究具备开拓性的意义。2.本专利技术的方法快速简便：本专利技术所建的RT-PCR方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。3.本专利技术的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了PCR方法扩增的高度特异性。附图说明图1为本专利技术提供的感染黄鳝弹状病毒的黄鳝苗种主要临床症状为头部肿大示意图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。实施例1：一种黄鳝弹状病毒CrERV，其分离过程如下：1)将携带病毒的黄鳝脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到鲫脑细胞系(GibelCarpBrain,GiCB)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GiCB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。培养基：M199，10％胎牛血清，pH7.0～7.22)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQIDNO.1所示。黄鳝弹状病毒的形态特征：病毒子弹状或梭形，病毒具有双层脂质囊膜，与典型的弹状病毒形态相符，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黄鳝弹状病毒(Chineserice-fieldeelrhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCCNO：V201819，地址：中国武汉武汉大学。有研究表明鳜鱼弹状病毒可以感染黄鳝，但是通过临床症状特征对比结果显示，感染鳜鱼弹状病毒的黄鳝主要出现出血现象，但是本申请中从患病黄鳝中分离的弹状病毒临本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离自黄鳝的弹状病毒，所述的弹状病毒为黄鳝弹状病毒（Chinese rice‑field eel rhabdovirus）CrERV，保藏编号为：CCTCC NO：V201819。

【技术特征摘要】
1.一种分离自黄鳝的弹状病毒，所述的弹状病毒为黄鳝弹状病毒（Chineserice-fieldeelrhabdovirus）CrERV，保藏编号为：CCTCCNO：V201819。2.权利要求1所述的弹状病毒的基因，所述的基因为SEQIDNO.1所示的多核苷酸。3.权利要求1所述弹状病毒的检测引物，所述的引物为：F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文枝，曾令兵，范玉顶，周勇，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42