新型茄科雷尔氏菌噬菌体及其组合物和应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物领域，具体提供了茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstonia solanacearum phage GP1)，保藏编号CCTCC M 2016633；GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2)，保藏编号CCTCC M 2016634；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)，保藏编号CCTCC M 2016635。本发明专利技术噬菌体具有的优势包括：为严格的烈性噬菌体并可有效杀灭不同植物宿主来源的茄科雷尔氏菌，尤其对导致姜瘟病的茄科雷尔氏菌；对正常微生物菌群无毒害作用；其DNA无法编码毒力基因；在pH5～pH9之间具有较强的稳定性；在4℃条件下保藏1年效价没有数量级变化；低效价情况下可有效抑菌杀菌等。本发明专利技术噬菌体可防治由茄科雷尔氏菌引发的作物青枯病，尤其是姜瘟病，为开发新型抗青枯病生物农药提供了优良的菌种资源，具有良好的应用开发前景。

Novel Solanaceae Phage and Its Composition and Application

The invention relates to the field of microorganisms, in particular to Ralstonia solanacearum phage GP1, preservation number CCTCC M 2016633, GP2 (Ralstonia solanacearum phage GP2), preservation number CCTCC M 2016634, and GP3 (Ralstonia solanacearum phage GP3), preservation number CCTCC M 2016635. The advantages of the bacteriophage of the present invention include: being a strict strong bacteriophage and being able to effectively kill Ralstonia solanacearum from different plant hosts, especially Ralstonia solanacearum causing ginger blast; having no toxic effect on normal microbial flora; unable to code virulence genes for its DNA; having strong stability between pH 5 and pH 9; having no quantity of titer after one year storage at 4 degrees Celsius; Grade change; effective bacteriostasis and sterilization under low potency. The bacteriophage of the invention can prevent and control crop bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum, especially ginger blast. It provides excellent germ resources for developing new bio-pesticides resistant to bacterial wilt and has good application and development prospects.

【技术实现步骤摘要】
新型茄科雷尔氏菌噬菌体及其组合物和应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及新的茄科雷尔氏菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用。
技术介绍
茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)是β-变形菌亚门的一类滋生于土壤的革兰氏阴性细菌。该病菌通常可从植物根部或茎部的伤口或是从没有受伤的次生根的根冠部位侵入皮层细胞间隙，通过破坏细胞间中胶层,使细胞壁分离,变形,形成空腔，进而侵染木质部薄壁组织使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体，并移入侵填体。待侵填体破裂后，茄科雷尔氏菌继续被释放进入导管,并在导管内大量繁殖和快速传播扩张,从而引起植株萎蔫死亡(何礼远,康耀卫.植物青枯菌(Pseudomonassolanacearum)致病机理。这种毁灭性的土传病害被称为作物青枯病，全世界每年因此病害所造成的经济损失数以亿计。茄科雷尔氏菌宿主广泛,能侵染包括生姜、烟草、番茄、马铃薯、花生、桑树以及木麻黄在内的50多科200多种作物。该病主要发生在亚热带和热带地区，并逐渐向温带地区扩散，其发病情况逐年加重。目前，对作物青枯病的防治方法主要包括化学防治、生物防治、种植抗病品种、作物轮作等，虽然对青枯病起到了一定程度的控制作用，但依然无法有效地控制该病发。噬菌体是一种通过与细菌细胞表面特异位点结合后杀灭特异性细菌的病毒，具有杀菌特异性强，对人畜无害，利用致病菌为宿主不断自我增殖等显著的优点，极具作为新型生物农药有效成分的开发潜质。迄今为止，国内外已报道的茄科雷尔氏菌噬菌体包括肌尾噬菌体ФRSA1、ФRSL1和∈RS-1；短尾科噬菌体ФRSB1和RSK1；丝尾噬菌体ФRSM1和ФRSS1，目前所发现的上述短尾科噬菌体均属于T7-likevirus属,还未见短尾科其它属噬菌体的报道。从应用的角度考虑，用于预防和治疗作物青枯病的茄科雷尔氏菌噬菌体应具备较宽的裂解谱(能够裂解来源于不同宿主作物和不同农业区的病原菌)，较强的稳定性(能适应田间温度以及不同的土壤pH值)以及可靠的安全性(应为烈性噬菌体，其基因组不能与宿主菌的基因组整合)等几个基本的特点。因此、有必要开发新的具有上述裂解谱宽、稳定性好、安全性高等特性的新型噬菌体。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术提供了3株茄科雷尔氏菌的噬菌体以及它们的组合物，本专利技术噬菌体具有较强的裂解不同作物来源的茄科雷尔氏菌的能力。本专利技术所述茄科雷尔氏菌噬菌体包括以下噬菌体：茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)、保藏编号为CCTCCM2016533，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日；茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)、保藏编号为CCTCCM2016534，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日；或茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)、保藏编号为CCTCCNO：M2016635，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)为烈性噬菌体，其形态为蝌蚪状，具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm，且在pH3～pH11、在4℃～40℃条件下具有耐性，MOI＝0.0000001条件下培养24h，其效价为4.3×1010pfu/mL；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)为烈性噬菌体，其形态为蝌蚪状，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm，且在pH3～pH11、在4℃～40℃条件下具有耐性，MOI＝0.0000001条件下培养24h，其效价为2.9×1010pfu/mL；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)为烈性噬菌体，其形态为蝌蚪状，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm，且在pH3～pH11、在4℃～40℃条件下具有耐性，MOI＝0.0000001条件下培养24h，其效价为6.7×1010pfu/mL；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)的主要结构蛋白相对分子量为17kDa和45kDa；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)的主要结构蛋白相对分子量为17kDa和45kDa；本专利技术中，作为实施方案之一，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)的主要结构蛋白相对分子量为17kDa和45kDa；噬菌体GP1的生物学特征：以来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌“3-2-1”为宿主菌，采用双层平板法于30℃下过夜培养，GP1可形成平均直径为1～2mm的噬菌斑(图1-A)；在电子显微镜下观察GP1噬菌体形态发现其形态为蝌蚪状，具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm(图2-A)。GP1噬菌体全基因组序列大小为61125bp，为双链线状DNA。本专利技术所述GP1属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)，Bcep22likevirus噬菌体属，为是新种噬菌体；基因组序列分析表明，GP1噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。噬菌体的溶原性鉴定试验结果表明GP1为烈性噬菌体。噬菌体GP2的生物学特征：以来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌“5-2-2”为宿主菌，采用双层平板法于30℃下过夜培养，GP2可形成平均直径为1～2mm的噬菌斑(图1-B)；在电子显微镜下观察GP2噬菌体形态发现其形态为蝌蚪状，具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm(图2-B)。GP2噬菌体全基因组序列大小为61130bp，为双链线状DNA。本专利技术所述GP2属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)，Bcep22likevirus噬菌体属，是新种噬菌体；基因组序列分析表明，GP2噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。噬菌体的溶原性鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新的茄科雷尔氏菌噬菌体，特征在于，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstonia solanacearum phage GP1)，保藏编号CCTCC M 2016633；GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2)，保藏编号CCTCC M 2016634；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)，保藏编号CCTCC M2016635。

【技术特征摘要】
1.新的茄科雷尔氏菌噬菌体，特征在于，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)，保藏编号CCTCCM2016633；GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)，保藏编号CCTCCM2016634；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)，保藏编号CCTCCM2016635。2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)为烈性噬菌体，其形态为蝌蚪状，具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm，且在pH3～pH11、在4℃～40℃条件下具有耐性，MOI＝0.0000001条件下培养24h，其效价为4.3×1010pfu/mL。3.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)为烈性噬菌体，其形态为蝌蚪状，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm，且在pH3～pH11、在4℃～40℃条件下具有耐性，MOI＝0.0000001条件下培养24h，其效价为2.9×1010pfu/mL。4.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)为烈性噬菌体，其形态为蝌蚪状，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为60～70nm，尾部长约为15～20nm，且在pH3～pH11、在4℃～40℃条件下具有耐性，MOI＝0.0000001条件下培养24h，其效价为6.7×1010pfu/mL。5.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralsto...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文建，丁良，肖逍，苏胜兵，于浩，丛郁，徐旭凌，赵伟，王艳，周思翔，熊剑胜，王卫斌，马克·恩格尔，沈婵娟，
申请(专利权)人：菲吉乐科南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32