一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，公开了一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法，分离培养包括：1）先用胰酶溶液对黄姑鱼脂肪组织块消化，然后使用Ⅱ型胶原酶消化液处理黄姑鱼脂肪组织块；2）将解离的黄姑鱼前体脂肪细胞接种到细胞培养瓶中，采用前体脂肪细胞培养基进行培养，形成细胞单层。诱导方法为将获得的黄姑鱼前体脂肪细胞用胰酶溶液消化处理后，接种到6孔板中培养，然后转移至前体细胞诱导培养基中继续培养。本发明专利技术能够成功获得黄姑鱼前体脂肪细胞以及进一步诱导获得成熟脂肪细胞，具有方法简便易行、重复性好、成本低和细胞生长迅速的优点，可为黄姑鱼营养代谢的分子细胞生物学研究提供有效的体外细胞模型。

【技术实现步骤摘要】
一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法。
技术介绍
脂肪组织是以甘油三酯形式贮存脂肪的重要器官，近年来随着水生生物学的发展，对水生生物脂肪组织的认识进一步加深。黄姑鱼作为东海地区重要的养殖鱼类，其生理代谢得到了广泛的研究，但关于脂肪组织的研究甚少。目前，鱼类脂肪细胞培养主要采用胶原酶解法进行，如申请号为201110030738.9的中国专利公开了一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包括以下步骤：1）取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；2）将上述脂肪组织经过细胞分散处理（胶原酶II消化液），得大黄鱼前体脂肪细胞；3）将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；完全培养基为含20%胎牛血清培养液；4）原代培养：将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，可进行传代接种培养。使用本专利技术的方法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。但是本专利技术团队在采用上述方法对黄姑鱼进行脂肪细胞分离实验时发现，采用胶原酶解法获得的黄姑鱼脂肪组织单细胞量很少，而若增大胶原酶浓度则细胞成活率低。因此，采用上述传统的胶原酶解法并不适用于黄姑鱼。此外，本专利技术团队通过实验还发现，采用传统的其他鱼类的诱导方法也不能成功诱导黄姑鱼前体脂肪细胞分化成熟。因此，有必要开发出一种专门适用于黄姑鱼的前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法，本专利技术方法能够成功获得黄姑鱼前体脂肪细胞以及进一步诱导获得成熟脂肪细胞，具有方法简便易行、重复性好、成本低和细胞生长迅速的优点，可为黄姑鱼营养代谢的分子细胞生物学研究提供有效的体外细胞模型。本专利技术的具体技术方案为：一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：1）先用质量分数为0.2-0.3%的胰酶溶液对黄姑鱼脂肪组织块消化5-10min，然后使用Ⅱ型胶原酶消化液处理黄姑鱼脂肪组织块12-16h，获得黄姑鱼前体脂肪细胞。2）将解离的黄姑鱼前体脂肪细胞接种到细胞培养瓶中，置于25-30℃的细胞培养箱中，采用前体脂肪细胞培养基进行培养，形成细胞单层。本专利技术团队在采用专利201110030738.9中的方法对黄姑鱼进行脂肪细胞分离实验时发现，采用胶原酶解法获得的黄姑鱼脂肪组织单细胞量很少，而若增大胶原酶浓度则细胞成活率低。因此，采用上述传统的胶原酶解法并不适用于黄姑鱼。本专利技术团队经过大量研究后，采用特定的两步酶解法：第一步将脂肪组织小块使用胰蛋白酶酶解，酶解作用强但时间短；第二步将脂肪组织小块使用Ⅱ型胶原酶消化液低温处理，酶解作用弱，但时间长。两种酶解方法搭配不仅可以降低对细胞的损伤而且有利于获得大量单细胞。作为优选，步骤1）中，第一次消化处理的具体方式为：室温下，使用黄姑鱼脂肪组织块体积3-4倍的胰蛋白酶溶液进行消化，接着加入含有胎牛血清的培养基中止消化；用DMEM/F12培养基清洗黄姑鱼脂肪组织块。作为优选，步骤1）中，第二次消化处理的具体方式为：离心管中加入黄姑鱼脂肪组织块体积4-5倍的Ⅱ型胶原酶消化液与黄姑鱼脂肪组织块混合，置于2-6℃的层析冷柜四维旋转混合仪上以10-20rpm的速度进行消化。作为优选，步骤1）中，所述Ⅱ型胶原酶消化液的制备方法为：将Ⅱ型胶原酶、胎牛血清、青霉素和链霉素添加到含有钙镁离子的汉克斯平衡盐溶液中；其中Ⅱ型胶原酶的质量分数为0.08-0.12％，胎牛血清的体积分数为1.2-2.2%，青霉素的浓度为90-110IU/mL，链霉素的浓度为90-110μg/mL。作为优选，步骤1）中，所述黄姑鱼脂肪组织块的体积为0.8-1.2mm3。作为优选，步骤2）的具体过程为：胶原酶消化结束后，用100目尼龙筛绢过滤黄姑鱼脂肪组织块2次，将获得的单细胞悬液以700-900rpm离心8-12min，弃去上清并补充新鲜前体脂肪细胞培养基，重复3次；调整细胞浓度为0.95-1.05×106个/mL，吸取1mL单细胞悬液接种于细胞培养瓶中，轻轻震荡使细胞分散均匀，静置3-4h，补加前体脂肪细胞培养基至5mL，置于细胞培养箱中培养；细胞培养期间，每天观察1次，2-3天更换培养基。作为优选，步骤2）中，所述前体脂肪细胞培养基为含有8-12vol％胎牛血清、0.8-1.2mmol/L丙酮酸钠、1.8-2.2mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.08-0.12g/L的N-乙酰葡萄糖胺、90-110IU/mL青霉素和90-110μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基。本专利技术在前体脂肪细胞培养基中组合添加丙酮酸钠、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和N-乙酰葡萄糖胺，本专利技术团队发现，当特定的上述三种组分组合在一起时，可协同配合，显著改善前体脂肪细胞糖代谢水平，促进细胞增殖及降低细胞炎症。作为优选，步骤2）中，所述细胞培养瓶经过预处理：将黄姑鱼血清加入到细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，然后吸除多余黄姑鱼血清，25-30℃下静置24-48h。使用黄姑鱼血清预包被瓶底一方面可以降低细胞的排异反应，增加细胞的对培养瓶的贴附；另一方面，方便易得，由于同属血清，成分相近，可减少胎牛血清使用，降低实验成本。本专利技术还公开了一种对上述方法所得的黄姑鱼前体脂肪细胞进行诱导的方法：将获得的黄姑鱼前体脂肪细胞用胰酶溶液消化处理后，以4-6×105/孔浓度接种到6孔板中培养3-5天，然后转移至前体细胞诱导培养基中继续培养5-7天。其中，所述前体脂肪细胞诱导培养基为含有4-6vol％胎牛血清、0.4-0.6mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、8-12μg/mL胰岛素、0.2-0.3μM地塞米松、0.8-1.2vol%黄姑鱼肝脏脂质提取物、90-100IU/mL青霉素和90-110μg/L链霉素的DMEM/F12培养基。本专利技术团队经过实验发现，传统的诱导方法不能成功诱导黄姑鱼前体脂肪细胞分化成熟。为此，本专利技术在优化了脂肪前体组织细胞原代培养的酶解方法，调整了培养基的配方的基础上；在诱导培养基中添加了黄姑鱼肝脏脂质提取物，从而成功获得黄姑鱼成熟脂肪细胞。本专利技术人对比了黄姑鱼肝脏脂质提取物添加与否对前体脂肪细胞诱导分化成熟的影响，发现不添加黄姑鱼肝脏脂质提取物不能诱导黄姑鱼前体脂肪细胞分化成熟。黄姑鱼前体脂肪细胞的诱导分化成熟与淡水鱼（如草鱼）不完全一样，这也是本专利技术的创新点之一。作为优选，所述黄姑鱼肝脏脂质提取物为溶解有1.5-2.5g/L吐温20，0.8-1.2g/L酯化的黄姑鱼肝脏油脂和0.18-0.22g/L维生素E醋酸酯的DMEM/F12培养基。与现有技术对比，本专利技术的有益效果是：本专利技术优化了鱼类脂肪前体组织细胞原代培养的酶解方法，调整了培养基的配方；在诱导培养基中添加了黄姑鱼肝脏脂质提取物，从而成功获得黄姑鱼成熟脂肪细胞。附图说明图1为实施例1培养第3天黄姑鱼前体脂肪细胞光镜照片；图2为实施例1培养第1代黄姑鱼前体脂肪细胞光镜照片；图3为实施例1培养第15代黄姑鱼前体脂肪细胞光镜照片；图4为实施例2诱导后油红O染色的黄姑鱼成熟脂肪细胞光镜照片；图5为两种不同酶解方法对细胞增殖的影本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：1）先用质量分数为0.2‑0.3%的胰酶溶液对黄姑鱼脂肪组织块消化5‑10min，然后使用Ⅱ型胶原酶消化液处理黄姑鱼脂肪组织块12‑16h，获得黄姑鱼前体脂肪细胞；2）将解离的黄姑鱼前体脂肪细胞接种到细胞培养瓶中，置于25‑30℃的细胞培养箱中，采用前体脂肪细胞培养基进行培养，形成细胞单层。

【技术特征摘要】
1.一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：1）先用质量分数为0.2-0.3%的胰酶溶液对黄姑鱼脂肪组织块消化5-10min，然后使用Ⅱ型胶原酶消化液处理黄姑鱼脂肪组织块12-16h，获得黄姑鱼前体脂肪细胞；2）将解离的黄姑鱼前体脂肪细胞接种到细胞培养瓶中，置于25-30℃的细胞培养箱中，采用前体脂肪细胞培养基进行培养，形成细胞单层。2.如权利要求1所述的一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤1）中，第一次消化处理的具体方式为：室温下，使用黄姑鱼脂肪组织块体积3-4倍的胰蛋白酶溶液进行消化，接着加入含有胎牛血清的培养基中止消化；用DMEM/F12培养基清洗黄姑鱼脂肪组织块。3.如权利要求1或2所述的一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤1）中，第二次消化处理的具体方式为：离心管中加入黄姑鱼脂肪组织块体积4-5倍的Ⅱ型胶原酶消化液与黄姑鱼脂肪组织块混合，置于2-6℃的层析冷柜四维旋转混合仪上以10-20rpm的速度进行消化。4.如权利要求1所述的一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤1）中，所述Ⅱ型胶原酶消化液的制备方法为：将Ⅱ型胶原酶、胎牛血清、青霉素和链霉素添加到含有钙镁离子的汉克斯平衡盐溶液中；其中Ⅱ型胶原酶的质量分数为0.08-0.12％，胎牛血清的体积分数为1.2-2.2%，青霉素的浓度为90-110IU/mL，链霉素的浓度为90-110μg/mL。5.如权利要求1所述的一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤1）中，所述黄姑鱼脂肪组织块的体积为0.8-1.2mm3。6.如权利要求1所述的一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤2）的具体过程为：胶原酶消化结束后，用100目尼龙筛绢过滤黄姑鱼脂肪组织块2次，将获得的单细胞悬液以700-900rpm离心8-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭朋，楼宝，王立改，詹炜，刘峰，谢庆平，陈睿毅，徐冬冬，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33