一株Surfactin高产菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开了一种高产Surfactin的菌株及其应用。该菌株为枯草芽孢杆菌LM34S07，已于2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 15620。利用该菌株生产Surfactin具有合成速率快、产量高的突出优点，可应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品防腐保鲜、化妆品、医药、环保等领域，具有巨大的应用潜力和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一株Surfactin高产菌株及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高产Surfactin的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
技术介绍
Surfactin，中文名称表面活性素，是由芽孢杆菌属细菌经非核糖体途径合成的次级代谢产物，基本结构是由1个β-羟基脂肪酸和含7个氨基酸的多肽经内酯键连接而成的环状脂肽，因脂肪酸中碳链长度的不同，会出现分子量上相差一个或几个-CH2的同系物。Surfactin具有表面活性大、乳化和发泡性能良好的突出特性，能显著降低水的表面张力和其他液-液界面张力；另外，Surfactin还被证实具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗支原体、抗肿瘤等抗微生物活性；同时，由于Surfactin是由脂肪酸、多肽链连接而成的环状脂肽，Surfactin还具有易生物降解、对环境无污染等优异特性。正因为环脂肽Surfactin具有诸多突出特性，使得Surfactin、产Surfactin的微生物菌株被开发应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品加工、医药、化妆品、环保、石油开采等多个领域，备受国内外研究人员、工业开发人员等的青睐。但是，由于现有微生物菌株的Surfactin产率较低，导致Surfactin生产成本较高，Surfactin价格昂贵，大大限制了Surfactin应用范围、规模化生产和商业化开发应用。
技术实现思路
为了解决目前Surfactin产率低、无法满足工业化生产的问题，本专利技术提供一种高产Surfactin的菌株、生产方法及其应用。本专利技术提供了一株Surfactin高产菌株，该高产菌株为枯草芽孢杆菌LM34S07(BacillussubtilisLM34S07)，已于2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC15620，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术所提供的Surfactin高产菌株枯草芽孢杆菌LM34S07是由出发菌株枯草芽孢杆菌经亚硝基胍、He-Ne激光照射复合诱变选育得到。枯草芽孢杆菌LM34S07在营养琼脂平板上生长良好，菌落乳白色、不透明，菌落圆形、边缘不整齐；细胞杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形。本专利技术提供的菌株属于是国际上公认的安全菌种，被美国FDA和环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，也是我国农业部规定的免做安全鉴定的一级菌种之一。本专利技术提供了利用枯草芽孢杆菌LM34S07生产Surfactin的方法，包括：挑取菌株LM34S07一环，接入装有30-100mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，于30-35℃、150-200rpm下摇床培养16-24h，得种子液；将种子液按3-10%(v/v)的接种量接入装有100-200mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于30-35℃、150-200rpm下摇床培养28-48h，得发酵液；发酵培养基组成为葡萄糖15-35g、谷氨酸3-8g、酵母膏1-4g、磷酸二氢钾0.7-1.1g、氯化钾0.3-0.6g、七水硫酸镁0.3-0.6g、硫酸铜0.1-0.2mg、七水硫酸亚铁0.1-0.2mg、硫酸锰3-10mg、水1L，pH7.0，115℃灭菌30min。本专利技术提供了以枯草芽孢杆菌LM34S07或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌LM34S07的菌剂在饲料领域、农业领域的应用。本专利技术提供了以枯草芽孢杆菌LM34S07或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌LM34S07的菌剂在食品、医药、化妆品领域的应用。本专利技术提供了以枯草芽孢杆菌LM34S07或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌LM34S07的菌剂在环境保护领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一株高产Surfactin的枯草芽孢杆菌LM34S07，该菌株合成Surfactin速率快、产量高，发酵40h发酵液Surfactin含量高达9.78g/L；利用菌株LM34S07生产Surfactin可以大大降低生产成本，提高生产效率，具有巨大的工业化应用前景。附图说明图1Surfactin标准品HPLC图谱；图2甲醇抽提液样品HPLC图谱。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解，以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术、而不用于限制本专利技术的范围。实施例1：Surfactin高产菌株复合诱变选育挑取出发菌株一环接入装有10mL牛肉膏蛋白胨培养基的50mL三角瓶中，于33℃、175r/min摇床培养16h后，于4℃、8000r/min下离心15min，收集菌体，菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤3次，加入一定量pH7.0磷酸缓冲液悬浮菌体，得到用于复合诱变的菌悬液(108cfu/mL)；将1mL菌悬液、1mL浓度180ug/mL的亚硝基胍溶液于小试管中混合均匀，置于33℃水浴，期间采用He-Ne激光器照射(外腔式准单模He-Ne激光，波长632.8nm，照射功率为12mW)，每次照射持续2min，照射3次，水浴处理12min后，将上述混合液倒入48mL无菌生理盐水中，终止反应；然后，采用梯度稀释法将各稀释液涂布于血平板上，于33℃下恒温培养36h，挑取溶血圈大的菌落，转接保存，采用HPLC法检测突变株发酵液Surfactin产量，最终筛选得到Surfactin高产突变株LM34S07。实施例2：Surfactin含量检测将发酵液于4℃、12000rpm下离心20min，收集上清液，用浓盐酸调节上清液pH至2.0，4℃静置过夜后于4℃、12000rpm下离心20min，收集沉淀；向沉淀中加入5mL甲醇，于磁力搅拌器上搅拌30min后，放入4℃冰箱内静置抽提12h，抽提结束后于4℃、12000rpm离心20min，收集甲醇抽提液；按上述方法重复抽提3次，合并甲醇抽提液，经0.22um无菌微孔滤膜过滤后，4℃保存备用。采用HPLC进行Surfactin含量检测；色谱柱ZORBAXSB-C18(5μm，4.6×250mm)，柱温35℃，进样量20μl，波长205nm，流速0.8mL/min，流动相A纯水(含0.1%TFA)，流动相B乙腈(含0.1%TFA)；梯度洗脱条件为：0~9min，40%流动相A和60%流动相B；9~20min，7%流动相A和流动相B；由HPLC图谱显示，甲醇抽提液样品HPLC出峰时间（图2）与Surfactin标准品出峰时间（图1）基本相同，Surfactin标准品标准曲线回归方程为Y=0.08132X-41.76，相关系数R2=0.9937，将甲醇抽提液样品HPLC峰面积带入回归方程计算得到Surfactin浓度，进而换算出发酵液中Surfactin含量。实施例3：Surfactin发酵发酵培养基组成为葡萄糖20g、谷氨酸5g、酵母膏4g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、硫酸铜0.16mg、七水硫酸亚铁0.15mg、硫酸锰5mg、水1L，pH7.0，115℃灭菌30min。挑取菌株LM34S07一环，接入装有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，于33℃、175rpm下摇床培养18h，得种子液；将种子液按7%(v/v)的接种量接入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于33℃、175rpm下摇床培养40h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株Surfactin高产菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LM34S07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 15620，该菌株生产Surfactin速率快、产量高。

【技术特征摘要】
1.一株Surfactin高产菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLM34S07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC15620，该菌株生产Surfactin速率快、产量高。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LM34S07在生产Su...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41