【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米药物制备，更具体的说是涉及一种可协同化疗与基因疗法、用于抗多药耐药肿瘤的脂质-介孔硅纳米递送载体及其制备方法。
技术介绍
1、rna干扰(rna interference，rnai)技术是目前一种常用的基因干扰技术，是在靶细胞中引入内源性或外源性双链rna，引发同源性mrna降解，从而有效阻断特异性基因的表达，是一种序列特异性的转录后基因沉默。sirna是一种化学合成的ds rna，长度大约在19-23个碱基对，同时3’端会悬挂2个不配对的单核苷酸(dtdt)。sirna的功能行使过程是sirna和rna-induced silencing complex(risc)整合在一起，在argonaute 2(ago2)的催化下，切掉sirna中的正义链，仅留下反义链和risc组成的复合物。这个复合物最终识别与sirna反义链互补的mrna序列，导致mrna的切割，最终mrna片段被降解，目的蛋白表达量降低。肿瘤治疗中简单有效且最具普适性的治疗方法是化疗，但化疗药物除了对机体有明显副作用外，另一个重要问题是随着用药时间延长，癌细胞对药物的耐受性随之增强，即出现耐药性(mdr)。肿瘤耐药的主要机制为癌细胞内药物转运蛋白p-糖蛋白(p-gp)介导的药物外排，耐药基因mdr1超表达是其主要诱发原因。利用mdr1-sirna特异性抑制mdr1编码的mrna，可使p-gp表达下降，增强癌细胞对药物的敏感性，抗耐药效果好。但作为生物分子，sirna体内稳定性差，易被酸、酶等降解失活，难以单独应用。使用纳米载体包裹或负载化疗药物与
2、无机纳米粒子作为给药载体，具有可增强药物靶向转运、缓释和控释、低毒、生物相容性好等特点。其中介孔二氧化硅纳米粒(msns)由于具有较大的比表面积和孔体积、孔径大小和形貌均一可调、成本低廉、制备工艺简单、易于功能化修饰等优点，被广泛应用于生物医学领域。msns是一种良好的药物递送载体，遇酸可降解、具有ph敏感性，经聚电解质修饰可制得ph响应型载体系统，以温敏性材料修饰可制得温度响应型载体系统，而以生物分子如酶、抗原、葡萄糖等功能化修饰可制得微环境响应型载体系统。msns的中空纳米结构具有内部空隙和介孔壳，便于使用官能团进行修饰，允许其与生物活性分子进行有利的相互作用，有效控制药物吸附并调节释放速率。
3、脂质体(liposomes)是由双层脂质分子包裹亲水部分形成的微小球型囊泡，易穿过生物膜。ph敏感型脂质体通常由中性锥形脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和弱酸性两亲物琥珀酸胆碱(chems)组成，该型脂质体的脂质双层结构可在酸性肿瘤微环境中发生变化，促进膜不透性分子的细胞溶质释放；当与靶向配体组合时，可通过受体介导的内吞作用，高效靶向细胞溶质以递送生物活性物质。脂质双层涂层可以通过在msns表面的融合而成为一种新的复合纳米粒，这种集成的药物输送系统能够继承msns和liposomes的优点，并表现出优于其任何单一成分的特性。在复合纳米粒中，msns作为药物储库，能高效负载各种药物分子，并作为稳定脂质双层的支撑骨架。而脂质双层可以改善msns的分散性、稳定性和生物相容性，使其更适合用作药物载体。
4、谷胱甘肽(gsh)是细胞内最丰富的还原剂，据报道肿瘤细胞中gsh的浓度是正常细胞的3-4倍。以二硫键将硫化镉(cds)量子点修饰在二氧化硅孔道口，作为“门控开关”封闭释药孔道，以万古霉素和三磷酸腺苷为模型药，实验结果显示，在没有还原性物质二硫苏糖醇(dtt)或gsh存在条件下，药物基本不释放。而在加入dtt或gsh后，二硫键断裂，cds粒子脱落，药物随之释放。
5、透明质酸(hyaluronic acid,ha)，又名糖醛酸、玻尿酸，是一种酸性黏多糖。对其结构中存在的多种活性基团进行物理或化学修饰，可制备出各种具有不同性质的衍生物。因具有良好的生物相容性、生物可降解性、受体结合性，且免疫原性较低，ha及其衍生物已被广泛应用于递药载体构建。人体细胞内存在多种ha受体，ha及其衍生物可与细胞表面的特异性受体结合，作为靶向给药的基础。目前研宄较多的有ha-介导能动性(rhamm)受体、ha内吞受体、淋巴管内皮细胞ha-1受体等。其中cd44受体和rhamm受体被发现在多种肿瘤细胞表面过度表达，可与ha修饰的药物载体高效结合，实现主动靶向递送。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种可用作化疗药物与sirna共递送载体的功能化lmsns纳米粒及其制备方法。首先合成msns，连接上巯基得msns-sh，再合成s-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶(py-ss-nh2)并与msns-sh反应，通过巯基置换反应将二硫键及氨基置换到msns上得msns-ss-nh2。使用亚磷酰胺法合成具有特定碱基序列的sirna，以msns-ss-nh2外层氨基所带正电荷吸附带负电荷的sirna，在其表面包裹一层ph敏感型脂质体，再在脂质体表面连接修饰剂ha，并负载抗肿瘤模型药物阿霉素(dox)，得到复合纳米递药系统ha-lmsns-ss-nh2@dox/sirna。
2、通过性质表征、载药量计算等方面的考察，探索出一种可重现、成本低、产品质量好的纳米载体制备方法。材料合成后表征的主要目的是验证相关基团是否修饰成功，以及修饰后复合载体性质的变化。使用紫外分光光度法定量测定dox，以乳腺癌mcf-7细胞及其耐药株mcf-7/adr作为模型，考察递药系统的体外释药、细胞毒性、细胞摄取等。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、一种脂质-介孔硅纳米递送载体的制备方法，包括以下步骤：
5、(1)以改良水热法合成msns，与3-巯基丙基三甲氧基硅烷(mptms)反应连接上巯基得msns-sh，将msns-sh与合成的s-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶(py-ss-nh2)反应得到msns-ss-nh2，再利用外层氨基所带正电荷吸附带负电荷的sirna得到msns-ss-nh2/sirna；
6、步骤(1)所述msns的制备方法包括以下步骤：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(ctab)为模板剂，正硅酸乙酯(teos)为硅源，在碱性条件下反应，再在含硝酸铵的乙醇溶液中回流，之后以无水乙醇清洗除去模板剂，即得；ctab：teos的质量体积比为1g：5ml；
7、步骤(1)所述msns-sh的制备方法包括以下步骤：向msns中加入适量无水乙醇和mptms，回流除模板剂即得msns-sh；
8、msns与mptms的质量比为5-10:1；
9、步骤(1)所述s-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶(py-ss-nh2)的制备方法包括以下步骤：将2,2'-二硫二吡啶溶解在甲醇中，加入乙酸，搅拌15min，再将半胱胺盐酸盐溶解在甲醇中，反应后得到s-(2-氨基乙硫基)-2-硫本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脂质-介孔硅纳米递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述MSNs的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述MSNs-SH的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶(Py-SS-NH2)的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述MSNs-SS-NH2的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述MSNs-SS-NH2/siRNA的制备方法包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述pH敏感型脂质体的制备方法包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述HA-LMSNs-SS-NH2/siRNA的制备方法包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的制备方
10.一种由权利要求1-7任一制备方法得到的功能化修饰型脂质-介孔硅纳米递送载体，其粒径范围在180-210nm。
...【技术特征摘要】
1.一种脂质-介孔硅纳米递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述msns的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述msns-sh的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述s-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶(py-ss-nh2)的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述msns-ss-nh2的制备方法包括以下步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨硕晔，杨亚南，张倍倍，吕延腾，申微微，崔兰，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：
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