一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于甲壳类动物基因工程技术领域，公开了一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用,斑节对虾ALFpm12抗菌肽由123个氨基酸组成，分子量为13.54kDa，信号肽由25个氨基酸组成；ALFpm12与公开的斑节对虾ALF抗菌肽最高同源性仅有50％，在受副溶血弧菌入侵的斑节对虾各器官均显著上调，在4小时达到表达峰值；它的基因序列可由斑节对虾各组织提取的总RNA中通过RT‑PCR克隆获得。本发明专利技术抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌等具有抑菌、杀菌作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长、生产简单的特点，并且能够抑杀海水细菌，显示其在水产养殖行业具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用
本专利技术属于甲壳类动物基因工程
，尤其涉及一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：海洋面积占地球表面积三分之二，在维持全球气候中发挥重要作用，并为渔业，水产业的可持续发展提供稳定的生态环境。海洋中生长着味道鲜美、蛋白丰富的鱼虾、贝类。随着海产养殖业的扩大发展，到2012年，水产业供给了6.66千万吨的海产品，包括175种海洋无脊椎动物，主要为甲壳类和软体动物。其中，养殖的甲壳类占海产品总体积的9.7％，但价值占到了22.4％。近年来，我国渔业经济发展迅速，水产养殖占到了全球养殖的70％。但是，随着我国水产养殖业精养、半精养等养殖模式的发展，集约化程度的日益提高，残饵、粪便、水生动植物尸体等富营养因子共存于一个水体，加之水源的污染和池塘自净与调节能力的降低，导致养殖水体中化学需氧量、生物耗氧量、氨氮、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，病原微生物种类和数量上升，养殖环境恶化导致鱼虾病害频频发生。例如2015年，珠三角的南美白对虾养殖成功率不足2成。2016年，广东对虾产量产值均明显下降，收入下降了25.6％。目前，针对集约化养殖导致养殖动物病害频发的主要防治方法是使用抗生素和化学药物，尤其是抗生素的大量使用给食品安全及出口贸易带来了巨大安全隐患，同时导致耐药病原增多、环境污染加剧、生态风险升高等一系列问题。抗生素滥用问题在水产养殖业尤其严重，我国已成为世界上滥用抗生素最严重的国家之一，2015年我国抗生素总使用量估计约18.2万吨，其中约52％用于农业、养殖业。因此，为了保障人民群众的饮食健康，提高产品品质出口创汇，增加养殖户的经济效益，急需寻找一种解决病害频发的方法，开发出绿色、环保、无害、高效的抗生素替代品，实现科学养殖、生产绿色产品。抗菌肽(Antimicmbia1peptides，AMPs)是生物体合成的一类小分子防御多肽，在抗生素替代和绿色养殖中具有重要意义，它是动物免疫防御体系在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，能提高生物非特异免疫活性，杀死入侵的微生物，具有活性高、特异性强等特点。研究表明抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞，在快速杀菌的同时，不会导致脓毒症，同时具有中和内毒素、调节增加机体免疫力等特性，使其最有可能替代抗生素成为新一代相对安全的抗菌药物。虽然，天然抗菌肽具有高活性、低毒性等特点，但也存在含量低、稳定性较差、生产成本高等问题，导致其不能在医药、食品及养殖领域获得广泛应用。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)至今仍未获得能快速杀灭病毒、弧菌等高危病害菌的对虾抗菌肽。对虾属于非脊椎动物，关于它的基础研究比较薄弱，免疫机理尚不完全清楚，抗菌肽的种类及作用机理都在研究之中。目前，已公开的对虾抗菌肽种类和数量均远远少于其他物种，阻止了其开发与应用。(2)对虾抗菌肽在对虾体内含量低、提取困难，成本高。通过化学合成方法获得抗菌肽的技术也面临成本高、活性不如天然抗菌肽等问题。以上方法均不适合抗菌肽的规模化生产及应用。(3)采用基因工程生产抗菌肽具有成本低、工业化前景好等优点，但也得解决原核表达带来的易形成包涵体、活性低，真核表达产量低、过度修饰等问题。综合以上原因，至今未获得具有高效杀菌活性且可应用于对虾病害防治的对虾抗菌肽。解决上述技术问题的难度和意义：难度在于：对虾养殖业也是近年发展非常快，高密度养殖和水质恶化引发了大规模的虾病爆发,使海产养殖业遭受严重损失，如何防治虾病仍然是对虾养殖业的难题。如何利用生物技术获得新颖、抗菌活性高的对虾抗菌肽并实现它在水产养殖行业的推广应用则是解决这个难题的关键。解决现有技术的问题后，带来的意义为：1997年Destoumieux等从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，从中克隆得到一条虾抗菌肽。研究表明抗菌肽是对虾防御机制中的重要组成部分，是第一道天然防线。对虾抗菌肽新种类的发现和研究将有助于建立绿色、安全的对虾养殖技术。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用。本专利技术是这样实现的，一种斑节对虾抗菌肽ALFpm12，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12共123个氨基酸，分子量约为13.54kDa，氨基酸序列为：SEQIDNO：1。本专利技术抗菌肽序列与现有斑节对虾的抗菌肽只有50％的同源性，属于斑节对虾ALF家族新型的抗菌肽。进一步，所述斑节对虾ALFpm12基因的cDNA序列SEQIDNO：4共有661个碱基，1-143及516-661为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQIDNO：2，共25个氨基酸。进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQIDNO：3。本专利技术的另一目的在于提供一种新型斑节对虾抗菌肽ALFpm12的原核表达方法，包括：通过原核表达系统获得，将ALFpm12的基因序列连接到pSmartI、pColdIV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm12融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm12抗菌肽。进一步，ALFpm12的基因获得方法包括：斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理4h的斑节对虾组织，采用试剂盒提取细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；根据ALFpm12的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞和组织的总cDNA为模板，通过PCR克隆获得ALFpm12序列，上游引物为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG3'，获得约661bp的特异性cDNA片段，经测序得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因。进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，具体包括：1)斑节对虾总RNA的提取：斑节对虾组织的收集：斑节对虾用副溶血弧菌处理4小时，然后分离斑节对虾的胃、血、肝和肠等组织，放入液氮冷冻处理，存放于负八十摄氏度冰箱，即可用于后续的总RNA提取；总RNA的提取：采取RNeasyMiniKit提取斑节对虾的总RNA，称取不超过30mg的斑节对虾组织，在液氮条件下研磨成粉末，然后转移到干净的离心管中；加入BufferRLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的BufferRPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-freewater，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；2)抗菌肽cDNA序列的克隆：根据斑节对虾ALFpm12抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾细胞中克隆获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12共123个氨基酸，分子量为13.54kDa，氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12共123个氨基酸，分子量为13.54kDa，氨基酸序列为：SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，所述斑节对虾ALFpm12基因的cDNA序列SEQIDNO：4共有661个碱基，1-143及516-661为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQIDNO：2，共25个氨基酸。3.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12氨基酸序列与现有斑节对虾的抗菌肽有50％的同源性。4.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQIDNO：3。5.一种如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12的斑节对虾抗菌肽抗ALFpm12的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽抗ALFpm12的制备方法包括：通过原核表达系统，将ALFpm12的基因序列连接到pSmartI、pColdIV质粒上，与SUMO蛋白基因序列相连，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm12融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm12抗菌肽。6.如权利要求5所述的斑节对虾抗菌肽抗ALFpm12的制备方法，其特征在于，ALFpm12的基因获得方法包括：斑节对虾先用溶血弧菌进行处理，收集处理4h的斑节对虾各组织，采用试剂盒提取细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；根据ALFpm12的cDNA序列设计引物，以斑节对虾的总cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG3'，获得约661bp的特异性cDNA片段，经测序得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因。7.一种如权利要求1所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12的斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，具体包括：1)斑节对虾组织的收集和总RNA的提取：组织的收集：斑节对虾用副溶血弧菌处理4小时，然后分离斑节对虾的胃、血、肝和肠等组织，放入液氮冷冻处理，存放于负八十摄氏度冰箱，即可用于后续的总RNA提取；总RNA的提取：采取RNeasyMiniKit提取斑节对虾的总RNA，称取不超过30mg的斑节对虾组织，在液氮条件下研磨成粉末，然后转移到干净的离心管中；加入BufferRLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的BufferRPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-freewater，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；2)抗菌肽cDNA序列的克隆：根据斑节对虾ALFpm12抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG3'，采用RNeasyMiniKit提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScriptRTreagentKitwithgD...

【专利技术属性】
技术研发人员：王潮岗，周亮，李国强，胡章立，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44