侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2及其编码基因和应用，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术所述蛋白质能够诱导植物防御反应，提高植物抗性，所涉及的植物病害为烟草灰霉病。PeBL2不仅为揭示侧孢短芽孢杆菌A60菌株诱导植物抗性机制提供了理论基础，而且为提高植物的抗病性提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】
侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2及其编码基因和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL2及其编码基因和应用。
技术介绍
农作物病害中有70％是由病原真菌引起的，对农业生产造成了巨大的损失。过度依赖化学防治带来的农产品质量安全、人类和环境安全已经受到全球广泛关注，因此，寻求安全有效的生物防治策略成为保障农产品安全生产的重要研究内容。生防细菌作为一类重要的生物农药已经应用于农作物病虫害的生物防治，该类细菌不仅对靶标病害有直接杀死和生态位竞争作用，还能通过诱导植物抗性而抵御病害的侵染，从而减轻病害的发生，减少化学农药使用量。近年来，从生防细菌中分离鉴定植物免疫激发子越来越受到人们的关注，生防细菌激发子的鉴定不仅能为阐明生防细菌作用机制提供理论基础，同时也可将激发子开发成蛋白免疫诱导剂应用于农作物病害的生物防治，具有广阔的开发利用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够提高植物抗性的侧孢短芽孢杆菌分泌蛋白质PeBL2及其编码基因和应用。一种侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL2，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。本专利技术所述的侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL2在提高植物抗性中的应用。本专利技术所述的应用，其中所述植物为本生烟。一种PeBL2基因，其核苷酸序列为下列所述之一：(1)编码如SEQIDNO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；(2)与上述多核苷酸序列根据碱基配对原则互补的多核苷酸序列。本专利技术所述的PeBL2基因，其中，其多核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。一种重组载体，含有本专利技术所述的PeBL2基因。本专利技术所述的重组载体，其中所述载体为在pET28载体多克隆位点插入本专利技术所述的PeBL2基因的重组载体。一种遗传工程的宿主细胞，其含有本专利技术所述的重组载体。本专利技术所述的遗传工程的宿主细胞，其中所述宿主细胞为含有本专利技术所述的重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术的蛋白质，是指来自侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)A60的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。本专利技术侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL2与现有技术不同之处在于：本专利技术侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL2蛋白质可以明显提高植物对真菌病害的抗性，10μMHis-PeBL2处理本生烟叶3d后接种灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，病斑直径的最高抑制率可分别达到40.2％。微生物保藏信息本专利技术所述的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)A60菌株是本实验室从海南昌江土壤中分离出的高活性生防菌株，已经于2012年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，登记入册编号CGMCCNo：5694。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。下面结合附图对本专利技术的侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL2蛋白质及其编码基因和应用作进一步说明。附图说明图1为本专利技术中粗蛋白通过阳离子交换柱HiTrapSPFF的色谱图；A、B代表2个洗脱峰；图2A为本专利技术中利用Agilent1200HPLC高效液相色谱对洗脱峰B进行反相柱层析的图谱，其中A、B、C、D、E、F代表五个洗脱峰；图2B为不同洗脱峰的激发子活性检测结果；图3A为本专利技术中纯化蛋白PeBL2的SDS-PAGE图谱；M代表Marker；图3B为纯化蛋白PeBL2的活性检测；图4为His-PeBL2处理和对照烟草叶片活性氧物质的定性检测图；左为对照，右为处理；图5为His-PeBL1诱导本生烟抑制灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)的侵染实验结果图。具体实施方式实施例1侧孢短芽孢杆菌A60培养及发酵代谢液制备采用LB培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g溶于蒸馏水1000ml，调节pH至7.5)。挑取活化单菌落于2L的LB培养基中进行摇瓶震荡培养，培养条件为30℃、180rpm培养大于48h。4600rpm离心去除菌体细胞，上清液用于蛋白分离。实施例2粗蛋白的制备和活性监测对所得上清液用0.45mm的滤膜(Whatman产品)抽滤两次，直至没有菌体。之后进行硫酸铵沉淀，缓慢加入硫酸铵使之达到80％饱和度，4℃搅拌过夜。12000rpm，20分钟离心收集沉淀。用25mmol/LMES-NaOH(pH6.2)对沉淀物进行重悬，再利用透析袋脱盐，透析袋选取截留分子量在8000D-12000D。首先使用蒸馏水作为透析液，透析三次后使用25mmol/LMES-NaOH(pH6.2)缓冲液，再进行透析2-3次，每次透析需要间隔约4h更换一次透析液，保证透析袋内外溶液能够保持盐浓度一致，同时也达到了更换缓冲液的目的。透析完成后，10000rpm，离心10min去除透析过程中产生的沉淀，得到粗蛋白溶液。生物活性的监测：以生长2个月，具有6-8片叶的本生烟为材料，以25mM、pH6.2的Mes-NaOH缓冲液为对照，粗蛋白溶液浓度为10μmol/L，利用1mL不带针头的注射器，将50μLMes-NaOH缓冲液、50μL粗蛋白溶液从叶子背面分别注射进叶片中去，以Tris-Hcl(PH7.8)溶液作为对照。24h观察是否有坏死斑形成。结果：注射粗蛋白溶液的叶片，注射部位6h后出现水渍斑，12h后注射处叶片变得透明较薄一些，24h后可以呈现典型的过敏反应，有坏死斑形成。对照并无任何反应，和正常叶片一样。实施例3粗蛋白溶液中蛋白质激发子的分离纯化及生物活性测定(1)离子交换层析分离使用explore10(GEHealthcare)蛋白质纯化仪对所得的粗蛋白进行进一步纯化。样品首先通过阳离子柱HiTrapSPFF阳离子交换柱(GEHealthcare)，每次上样40ml，平衡液为25mM的MES(pH6.2)，洗脱液为20mM的MES(pH6.2)与1MNaCl，流速2ml/min。进行线性洗脱(0％-100％，30min)，获得到蛋白质洗脱峰(见图1)，将各蛋白质洗脱峰组分脱盐后进行生物活性的检测，结果表明，蛋白质峰B可以引起本生烟的过敏反应。(2)反相层析纯化利用Agilent1200HPLC高效液相色谱纯化洗脱峰B，WatersAtlantisT3C18反相柱(2.1×150mm，3.5m，40℃)，平衡缓冲液为含有1％三氟乙酸的超纯水，洗脱缓冲液为100％乙腈。洗脱梯度：20min，水80％-0％；乙腈20％-100％，洗针上样，一次80ul，流速:1.0ml/min。多次重复上样收集各组分，反相层析图谱见图2A。将得到五个主要峰，按实施例2中生物活性的监测方法进行生测，D峰有明显激发子活性。结果见图2B。实施例4蛋白激发子的鉴定切取B5胶条进行质谱分析。使用TripleTOF5600TOFMS分析仪(AppliedBiosystems)分析制备型HPLC后收集的活性链段，并以MS扫描模式获得数据，扫描范围为250-2000(m/z)。使用串联飞行时间质谱仪5800MALDI-TOF/TOF，ABSCIEX)进一步分析，激光源为钕，波长355纳米：YAG激光加速电压为2kV，使用正离子模式和自动数据采集数据，一阶质谱扫描范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2在提高植物系统抗性中的应用。3.根据权利要求2所述的PeBL2在提高植物系统抗性中的应用，其特征在于：所述植物为本生烟。4.一种PeBL2基因，其特征在于，其核苷酸序列为下列所述之一：(1)编码如SEQIDNO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；(2)与上述多核苷酸序列根据碱基配对原则互补的多核苷酸序列。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱德文，古拉姆候赛因贾托，杨秀芬，曾洪梅，郭立华，李广悦，袁京京，王双超，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11