甲醇脱氢酶融合蛋白制造技术

本申请记载了融合蛋白，所述融合蛋白包括甲醇脱氢酶(MeDH)和至少一种其他多肽，所述至少一种其他多肽例如3‑己酮糖‑6‑磷酸脱氢酶(HPS)或6‑磷酸‑3‑己酮糖异构酶(PHI)，所述6‑磷酸‑3‑己酮糖异构酶例如DHAS合成酶或果糖‑6‑磷酸醛缩酶或例如DHA合成酶或DHA激酶。该融合蛋白可以以局部方式促进甲醇转化为甲醛，然后转化为磷酸酮糖如己酮糖‑6‑磷酸，或然后转化为DHA和G3P。当在细胞中表达时，融合蛋白可以促进甲醇吸收并快速转化为磷酸酮糖或转化为DHA和D3P，其又可用于生产期望的生物产品的途径中。有利的是，快速转化为磷酸酮糖或DHA和G3P可以避免细胞中的甲醛不良积累。本申请还记载了表达该融合蛋白的工程细胞，其可选地包括一种或多种额外的代谢途径转基因、甲醇代谢途径基因、目标产物途径基因、包括所述细胞的细胞培养物组合物、用于提高细胞产生所述目标产物或其中间体的方法、包括所述目标产物或其中间体的组合物，和从所述目标产物或其中间体制得的产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甲醇脱氢酶融合蛋白优先权要求本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时专利申请62/249,032和于2015年11月25日提交的美国临时专利申请62/260,189的优先权，其全部内容通过引用并入此处。同时，亦以引用的方式将2016年10月26日创建的标题为“GNO0027WO_Sequence_Listing.txt”、大小为28kb的ASCII文本申请件的全部内容并入本申请。
本申请涉及含有甲醇脱氢酶的融合蛋白和表达这些融合体的工程细胞以及使用甲醇生产生物产品的方法。
技术介绍
在细胞内代谢途径中，代谢中间体是途径产物的前体分子，所述途径产物通常是生物学上重要的分子。各种因素可影响产物途径中代谢中间体的加工。当将中间体转化为随后的代谢物的过程中存在速率限制事件时，该中间体可能在细胞中积累。在一些情况下，中间体的积累可能会对细胞产生不利影响。例如，中间体的积累可能通过转移细胞内能源资源或通过减少生物重要产物的产生来间接影响细胞。在其他情况下，代谢中间体的积累可能对细胞产生直接的不良影响。例如，小分子如甲基乙二醛或甲醛浓度升高，可非特异性修饰细胞内蛋白质并对细胞健康产生不利影响。醇脱氢酶(ADH；EC1.1.1.1)促进醇类向醛类或酮类转化，通常伴随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原(NAD+至NADH)。ADH在各种代谢产物的生物合成过程中协助产生具有醛基、酮基和醇基的重要化合物。然而，部分所述化合物，例如含醛化合物，包括当在细胞中积累时会产生问题的甲醛。甲醇脱氢酶(MeDH)是醇脱氢酶中的一类。MeDH将甲醇(MeOH)转化为甲醛(Fald)，可用在工程化到微生物中的酶促途径里，使得MeOH成为唯一碳源或与其他原料(例如，葡萄糖、右旋糖、植物生物量或合成气)成为共同碳源，以产生有价值的产物。微生物代谢甲醇，且在某些情况下，经由甲醇脱氢酶进行所述代谢，并在更少的情况下，生产有价值的产物。增加MeDH活性将提高对MeOH的使用，促进MeOH作为唯一碳源，降低生产成本，减少更昂贵的次要或共同碳源(例如葡萄糖)的用量，增加产物产量，并提供更快的MeOH利用速度。
技术实现思路
本专利技术涉及包括甲醇脱氢酶活性和至少一种促进甲醛固定的其他活性的融合蛋白。例如，所述融合体可以包括促进甲醇转化为甲醛然后从甲醛转化为磷酸酮糖(如己酮糖6-磷酸或果糖-6-磷酸)的活性。可选地，例如，所述融合体可以包括促进甲醇转化为甲醛，然后从甲醛转化为二羟基丙酮(DHA)和甘油-3-磷酸(G3P)，然后转化为果糖-6-磷酸的活性。本专利技术还涉及表达这种融合蛋白的工程细胞，以及具有异源甲醇脱氢酶与促进甲醛固定的融合蛋白组合的工程细胞。通过甲醇脱氢酶融合体表达增加和/或通过使用活性变体、或通过融合增加甲醛固定成酮磷酸化合物的效率，工程细胞可以显示增加的甲醇吸收。尽管这促进了甲醛形成的增加，但是因为融合蛋白中由于酶活性的局限，甲醛更快地固定到磷酸酮糖化合物例如己酮糖6-磷酸或果糖-6-磷酸或DHA和G3P中。因此，不会在细胞内积聚甲醛不良水平并对生长造成不利影响。此外，酮糖磷酸化合物或DHA和G3P的通量和形成可增加，提供糖酵解途径的前体。反过来，增加的糖酵解可以增加随后的中间化合物如甘油3-磷酸，丙酮酸和乙酰-CoA。这些中间体化合物可以用于形成所需(目标)生物产品的产物途径，例如丁二醇(BDO)如1,3-丁二醇(1,3-BDO)和1,4-丁二醇(1,4-BDO)，4-羟基丁酸(4-HB)、丁二烯、6-氨基己酸(6ACA)、六亚甲基二胺(HMDA)、己二酸、巴豆醇、甲基乙烯基甲醇、3-丁烯-1-醇、1,2-丙二醇(丙烯乙二醇)、正丙醇、1,3-丙二醇，等。因此，融合体可以在天然具有所述产物途径的细胞中表达，或者经工程化表达融合蛋白的细胞可以进一步工程化，以包括用于使用因表达本公开的融合蛋白而可用量增加的中间产物的目标产物途径酶。本专利技术的融合蛋白提高了微生物在作为碳源的甲醇上生长的能力。使用甲醇途径融合体的在甲醇上生长的提高，可能是由于融合体提供了几种益处：1)由于融合HPS的局部存在，甲醛(MeDH反应的潜在毒性产物)快速转化成己糖-6-磷酸(或可选地DHA和G3P)；2)甲醇途径中融合蛋白的效率增加减少了甲醇有效利用所需的总甲醇途径蛋白的量；3)甲醇途径融合蛋白的存在将反应向前推进甲醇利用方面所需的方向。在实施例中，本专利技术提供了融合蛋白，其包括：(1a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(1b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；(2a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶活性部分的，(2b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分的；和(2c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(3a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(3b)第二区域，其包含6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分；(4a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶活性部分，(4b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(4c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(5a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(5b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(5c)第三区域，其包含6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分；或(6a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(6b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；(6c)第三区域，其包含6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分；以及(6d)第四区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；其中，所述融合蛋白可选地包含位于所述融合蛋白的第一、第二和第三区域中的两个或更多个之间的一个或多个接头氨基酸序列。在针对具有一种或多种DHA途径酶融合蛋白的MeDH的替代实施例中，本专利技术提供了融合蛋白，其包括：(7a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(7b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；(8a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶活性部分，(8b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(8c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分的；(9a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(9b)第二区域，其包含F6P醛缩酶或其酶促活性部分的；(10a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分的，(10b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(10c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分的；(11a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(11b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(11c)第三区域，其包含F6P醛缩酶或其酶促活性部分；或(12a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(12b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；(12c)第三区域，其包含F6P醛缩酶或其酶促活性部分；以及(12d)第四区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；其中，所述融合蛋白可选地包含位于所述融合蛋白的第一、第二和第三区域中的两个或更多个之间的一个或多个接头氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白，其包含：(1a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(1b)第二区域，其包含3‑己酮糖‑6‑磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；(2a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(2b)第二区域，其包含3‑己酮糖‑6‑磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(2c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(3a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(3b)第二区域，其包含6‑磷酸‑3‑己酮糖异构酶或其酶促活性部分；(4a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(4b)第二区域，其包含3‑己酮糖‑6‑磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(4c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(5a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(5b)第二区域，其包含3‑己酮糖‑6‑磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(5c)第三区域，其包含6‑磷酸‑3‑己酮糖异构酶或其酶促活性部分；或(6a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(6b)第二区域，其包含3‑己酮糖‑6‑磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；(6c)第三区域，其包含6‑磷酸‑3‑己酮糖异构酶或其酶促活性部分；和(6d)第四区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；其中，融合蛋白可选地包含位于融合蛋白的第一、第二和第三区域中的两个或更多个之间的一个或多个接头氨基酸序列；或DHA途径融合蛋白，其包含：(7a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(7b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；(8a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(8b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(8c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(9a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(9b)第二区域，其包含果糖‑6‑磷酸醛缩酶或其酶促活性部分；(10a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(10b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(10c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(11a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(11b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(11c)第三区域，其包含果糖‑6‑磷酸醛缩酶或其酶促活性部分；(12a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(12b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；(12c)第三区域，其包含果糖‑6‑磷酸醛缩酶或其酶促活性部分；和(12d)第四区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；其中，融合蛋白可选地包含位于融合蛋白的第一、第二和第三区域中的两个或更多个之间的一个或多个接头氨基酸序列。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 US 62/249,032;2015.11.25 US 62/260,1891.融合蛋白，其包含：(1a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(1b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；(2a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(2b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(2c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(3a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(3b)第二区域，其包含6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分；(4a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(4b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(4c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(5a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(5b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；和(5c)第三区域，其包含6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分；或(6a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(6b)第二区域，其包含3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分；(6c)第三区域，其包含6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分；和(6d)第四区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；其中，融合蛋白可选地包含位于融合蛋白的第一、第二和第三区域中的两个或更多个之间的一个或多个接头氨基酸序列；或DHA途径融合蛋白，其包含：(7a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(7b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；(8a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(8b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(8c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(9a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，和(9b)第二区域，其包含果糖-6-磷酸醛缩酶或其酶促活性部分；(10a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(10b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(10c)第三区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；(11a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(11b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；和(11c)第三区域，其包含果糖-6-磷酸醛缩酶或其酶促活性部分；(12a)第一区域，其包含甲醇脱氢酶或其酶促活性部分，(12b)第二区域，其包含DHA合成酶或其酶促活性部分；(12c)第三区域，其包含果糖-6-磷酸醛缩酶或其酶促活性部分；和(12d)第四区域，其包含甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分；其中，融合蛋白可选地包含位于融合蛋白的第一、第二和第三区域中的两个或更多个之间的一个或多个接头氨基酸序列。2.融合蛋白，其包含：甲醇脱氢酶的第一和第二部分，以及(a)位于甲醇脱氢酶的第一和第二部分之间的3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶或其酶促活性部分、6-磷酸-3-己酮糖异构酶或其酶促活性部分或甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分中的一种或多种，或者(b)位于甲醇脱氢酶的第一和第二部分之间的DHA合成酶或其酶促活性部分、F6PAld或其酶促活性部分，或甲醇脱氢酶活化剂或其酶促活性部分中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其具有以下结构：(i)1a-L1-1b或1b-L1-1a；(ii)2a-L1-2b-L2-2c、2a-L1-2c-L2-2b、2b-L1-2a-L2-2c、2b-L1-2c-L2-2a、2c-L1-2a-L2-2b、或2c-L1-2b-L2-2a；(iii)3a-L1-1b或3b-L1-3a；(iv)4a-L1-4b-L2-4c、4a-L1-4c-L2-4b、4b-L1-4a-L2-4c、4b-L1-4c-L2-4a、4c-L1-4a-L2-4b或4c-L1-4b-L2-4a；(v)5a-L1-5b-L2-5c、5a-L1-5c-L2-5b、5b-L1-5a-L2-5c、5b-L1-5c-L2-5a、5c-L1-5a-L2-5b或5c-L1-5b-L2-5a；或(vi)6a-L1-6b-L2-6c-L3-6d、6a-L1-6b-L2-6d-L3-6c、6a-L1-6c-L2-6b-L3-6d、6a-L1-6c-L2-6d-L3-6b、6a-L1-6d-L2-6b-L3-6c、6a-L1-6d-L2-6c-L3-6b、6b-L1-6a-L2-6c-L3-6d、6b-L1-6a-L2-6c-L3-6d、6b-L1-6c-L2-6a-L3-6d、6b-L1-6c-L2-6d-L3-6a、6b-L1-6d-L2-6a-L3-6c、6b-L1-6d-L2-6c-L3-6a、6c-L1-6a-L2-6b-L3-6d、6c-L1-6a-L2-6d-L3-6b、6c-L1-6b-L2-6a-L3-6d、6c-L1-6b-L2-6d-L3-6a、6c-L1-6d-L2-6a-L3-6b、6c-L1-6d-L2-6b-L3-6a、6d-L1-6a-L2-6b-L3-6c、6d-L1-6a-L2-6c-L3-6b、6d-L1-6b-L2-6a-L3-6c、6d-L1-6b-L2-6c-L3-6a、6d-L1-6c-L2-6b-L3-6a和6d-L1-6c-L2-6a-L3-6b；其中L1、L2和L3独立地选自(-)(共价键)和接头氨基酸序列；或者根据权利要求1所述的融合蛋白，其具有以下结构：(i)7a-L1-1b或1b-L1-7a；(ii)8a-L1-8b-L2-8c、8a-L1-8c-L2-8b、8b-L1-8a-L2-8c、8b-L1-8c-L2-8a、8c-L1-8a-L2-8b或8c-L1-8b-L2-8a；(iii)9a-L1-9b或9b-L1-9a；(iv)10a-L1-10b-L2-10c、10a-L1-10c-L2-10b、10b-L1-10a-L2-10c、10b-L1-10c-L2-10a、10c-L1-10a-L2-10b或10c-L1-10b-L2-10a；(v)11a-L1-11b-L2-11c、11a-L1-11c-L2-11b、11b-L1-11a-L2-11c、11b-L1-11c-L2-11a、11c-L1-11a-L2-11b或11c-L1-11b-L2-11a；或(vi)12a-L1-12b-L2-12c-L3-12d、12a-L1-12b-L2-12d-L3-12c、12a-L1-12c-L2-12b-L3-12d、12a-L1-12c-L2-12d-L3-12b、12a-L1-12d-L2-12b-L3-12c、12a-L1-12d-L2-12c-L3-12b、12b-L1-12a-L2-12c-L3-12d、12b-L1-12a-L2-12c-L3-12d、12b-L1-12c-L2-12a-L3-12d、12b-L1-12c-L2-12d-L3-12a、12b-L1-12d-L2-12a-L3-12c、12b-L1-12d-L2-12c-L3-12a、12c-L1-12a-L2-12b-L3-12d、12c-L1-12a-L2-12d-L3-12b、12c-L1-12b-L2-12a-L3-12d、12c-L1-12b-L2-12d-L3-12a、12c-L1-12d-L2-12a-L3-12b、12c-L1-12d-L2-12b-L3-12a、12d-L1-12a-L2-12b-L3-12c、12d-L1-12a-L2-12c-L3-12b、12d-L1-12b-L2-12a-L3-12c、12d-L1-12b-L2-12c-L3-12a、12d-L1-12c-L2-12b-L3-12a和12d-L1-12c-L2-12a-L3-12b；其中，L1、L2和L3独立地选自(-)(共价键)和接头氨基酸序列。4.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征在于，甲醇脱氢酶、甲醇脱氢酶活化剂、3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、DHA合成酶、果糖-6-磷酸醛缩酶或其酶促活性部分中的一种或多种来自细菌。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，甲醇脱氢酶、甲醇脱氢酶活化剂、3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、DHA合成酶、果糖-6-磷酸醛缩酶或其酶促活性部分中的一种或多种来自芽孢杆菌。6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，甲醇脱氢酶、甲醇脱氢酶活化剂、3-己酮糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、DHA合成酶、果糖-6-磷酸醛缩酶或其酶促活性部分中的一种或多种来自甲醇芽孢杆菌MGA3或甲醇芽孢杆菌PB1。7.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征在于，甲醇脱氢酶(MeDH)或其酶促活性部分来自甲醇芽孢杆菌MGA3MeDH(3EIJ77596.1)；甲醇芽孢杆菌C1MeDH(AAA22593.1)；甲醇芽孢杆菌PB1MeDH(EIJ77618.1)；甲醇芽孢杆菌PB1MeDH(EIJ78790.1)；甲醇芽孢杆菌MGA3MeDH(EIJ80770.1)；甲醇芽孢杆菌PB1MeDH(EIJ78397.1)；甲醇芽孢杆菌MGA3MeDH(EIJ83020.1)；梭形赖氨酸芽孢杆菌MeDH(EFI69743.1)；凝结芽孢杆菌36D1MeDH(YP_004860127.1)；球形赖氨酸芽孢杆菌MeDH(YP_001699778.1)；产氮芽孢杆菌LMG9581MeDH(ZP_11313277.1)；泰国伯克氏菌株E264MeDH(ZP_05587334.1)；钩虫贪铜菌N-1MeDH(YP_004681552.1)；未培养生物体MeDH(AGF87161)；GeobacterbemidjiensisBemMeDH(YP_002138168.1)；生氢氧化碳嗜热菌Z-2901MeDH(YP_359772.1)；产琥珀酸放线杆菌130ZMeDH(...

【专利技术属性】
技术研发人员：纳尔逊·R·巴顿，李静怡，约瑟夫·R·华纳，普里蒂·法克雅，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：美国,US