使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤，(1)将超敏蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中，(2)将插入了所述超敏蛋白的质粒转入短短芽孢杆菌宿主中，(3)发酵培养所述短短芽孢杆菌，(4)分离提取所述超敏蛋白。

Secretion and expression of hypersensitive proteins by Bacillus brevis

The present invention relates to a method for secreting and expressing hypersensitive proteins using Bacillus brevis. The method comprises the following steps: (1) inserting the coding gene of the hypersensitive protein into the plasmid hosted by Bacillus brevis; (2) transferring the plasmid inserted with the hypersensitive protein into the host of Bacillus brevis; (3) fermenting and culturing the Bacillus brevis; (4) isolating and extracting the supersensitive protein. Sensitive protein.

【技术实现步骤摘要】
使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法。
技术介绍
化肥和农药是提高作物产量和防治病虫害的主选产品，但同时产生了环境、能源以及成本等方面的问题，成为现在困扰世界各国的经济与社会发展的重大，严重制约着农业的可持续性发展。而利用来自微生物或真菌的蛋白质制备的生物制品(包括生物肥料和生物农药)是当代作物优质、高效和无公害生产的主要措施。近年来，国内外在此方面已开展了大量的科学研究。早期的微生物蛋白主要是来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白(ICP),新型微生物蛋白主要是蛋白激发子类物质，目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)，这些蛋白质不直接杀灭害虫和病原物，也不直接提供营养物质，而是在促进植物生长发育和对营养物质的吸收、增强植物的广谱抗病性(包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性)、增强植物的驱虫性、增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)、延长作物产品的储存时间、对盆花和苗木的塑形作用方面有广泛应用前景。因此，它们可以配制成生物制品，应用到以上方面。这些新型微生物蛋白或多肽大都通过发酵重组大肠杆菌等生物工程菌来实现大批量生产，在发酵后的下一步工艺为溶解细菌悬浮液中的细菌细胞以释放微生物蛋白或多肽。细胞溶解的方法有非化学的方法，如高压或超声波处理，使用该方法对设备要求较高，能耗高且难以大规模应用。作为另外的选择，大部分厂商采用将细胞悬浮液与溶菌酶接触来进行，之后还需要进行40-42℃消化，离心去细胞碎片和变性蛋白，以及蛋白纯化工艺以达到需要的纯度。这些工艺操作复杂，成本昂贵，且由于步骤多，过程冗长，会降低微生物蛋白和多肽的收率，并降低它们的生物活性和稳定性。因此，需要有步骤简便、成本低廉的方法用于这类新型微生物蛋白或多肽的生产。
技术实现思路
为了解决上述问题，提供一种简便、快速的超敏蛋白的制备方法，本专利技术提供如下技术方案。本专利技术首先涉及一种使用短短芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)作为宿主菌，发酵培养生产目的蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤，(1)将所述目的蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中，(2)将插入了所述目的蛋白的质粒转入短短芽孢杆菌宿主中，(3)发酵培养所述短短芽孢杆菌，(4)分离提取所述目的蛋白。步骤(1)所述的目的蛋白为超敏蛋白、优选为来源于菌株Erwiniaamylovora的GeneBank编号为M92994.3的harpinEa蛋白；步骤(1)所述的质粒为pNC-hisT质粒；步骤(2)所述的将质粒转入短短芽孢杆菌宿主中的方法为电击转化方法；步骤(3)所述的发酵培养的培养条件为：T2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h，优选的，发酵培养条件是：T2培养基、温度33℃、转速120rpm、发酵培养时间48h；步骤(4)所述的分离提取所述目的蛋白的步骤是：收集发酵后的菌液，离心收集上清，对上清液进行切向流超滤及浓缩，获得目的蛋白超滤浓缩液。所述的切向流超滤的步骤是：(1)使用30KD孔径的中空纤维柱对上清液进行超滤，收集滤过液；(2)使用10KD孔径的中空纤维柱对回收滤液进行浓缩，浓缩至1/10体积时，加入等体积的蛋白缓冲液，所述蛋白缓冲液的配方为20mMTri-HCl、400mMNaCl、1mMEDTA，重复三次；(3)继续使用10KD孔径的中空纤维柱对步骤(2)所获得的蛋白浓缩液进行浓缩，浓缩至1/8体积，即得目的蛋白超滤浓缩液。附图说明图1、转入短短芽孢杆菌中分泌表达超敏蛋白(harpinEa)的pNC-harpinEa质粒的图谱，以圆环示意环状质粒DNA分子，基因表达方向在片段末端以箭头显示；该质粒的结构区域包括：harpinEa蛋白、分泌信号肽(secretionsignalpeptide)、基因启动子(T2promoter)、核糖体结合位(RBS)、复制子(repB)；在大肠杆菌中复制的氨苄抗性基因(AmpR)及复制起始区(oriC)；在短短芽孢杆菌中复制的新霉素抗性基因(NmR)及复制起始区(ori)。图2、不同发酵条件的pH和OD595随培养时间的变化曲线图，由左图表可知pH与温度成反比，由右图表可知OD595与温度成正比，结合两个图表可知pH和OD595随培养时间呈先上升后下降的趋势。图3、纯化后的短短芽孢杆菌分泌表达的harpinEa蛋白的电泳图，图中泳道1为蛋白分子量标准，单位千道尔顿(KD)；泳道2为发酵上清液；泳道3发酵上清经一步超滤浓缩后样品；泳道4、5分别为第一次和第二次洗滤的样品；泳道6-10表示洗滤三次后的harpinEa超敏蛋白溶液(44KD)从原液到16倍稀释进行的2倍梯度稀释样品；泳道11-15表示小牛血清蛋白(BSA)从2mg/ml到0.125mg/ml进行2倍梯度稀释样品。图4、不同处理下辣椒植物学性状，左图为试验组处理区的辣椒作物植物学性状实物图；右图为对照组处理区的辣椒作物植物学性状实物图。喷施harpinEa超敏蛋白的辣椒作物植株更健壮，发病率更低，增产可达40.35％。具体实施方式实施例1、超敏蛋白(harpinEa)的序列获取来源于菌株Erwiniaamylovora编码harpinEa蛋白的基因hrpN序列已经公开(GeneBank编号：M92994.3)。超敏蛋白(harpinEa)基因的获得可以采用基因合成、PCR扩增、提取染色体DNA并建立文库等行业内公知的技术。本专利技术采用基因合成方法，将超敏蛋白(hrapinEa)氨基酸序列送合成(中国苏州金唯智生物科技公司)，合成时在目的序列的上游引入PstⅠ酶切位点序列，下游引入HindⅢ酶切位点序列。实施例2、构建pNC-harpinEa质粒质粒的原始骨架为pBU110，经商业公司改造为pNC-hisT(购自TaKaRa公司)，其载体多克隆位点区有PstⅠ和HindⅢ限制性酶切位点各一个，且整个载体有且只有一个PstⅠ和HindⅢ酶切位点。我们将上述质粒骨架DNA及harpinEa蛋白基因合成片段经PstⅠ和HindⅢ限制性内切酶处理后，使用T4连接酶连接成环状DNA并使用化学转化法转化进入大肠杆菌JM109感受态细胞中。经细胞培养以及碱裂解法抽提质粒，获得了可以转入短短芽孢杆菌中分泌表达超敏蛋白的pNC-harpinEa质粒，该质粒的图谱见图1。质粒序列的正确性经过了测序确认(中国苏州金唯智生物科技公司)。将测序正确的质粒经电击转化法转入短短芽孢杆菌(株系名称Brevibacillus.choshinensisSP3，购自TakaraBiomedicalTechnology(Beijing)Co.,Ltd.)电转感受态细胞中，经菌落PCR以确认阳性转化子，单克隆阳性转化子在含有新霉素的2SY培养基过夜培养并保藏菌种。实施例3、harpinEa蛋白的分泌表达将上述获得的阳性转化子在T2培养基中进行小量发酵筛选最佳表达条件。设置如下条件进行筛选，(1)两个温度条件，分别是30℃和33℃，(2)摇床转速三个条件，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用短短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)作为宿主菌，发酵培养生产超敏蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤，(1)将所述超敏蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中，(2)将插入了所述超敏蛋白的质粒转入短短芽孢杆菌宿主中，(3)发酵培养所述短短芽孢杆菌，(4)自发酵液中分离浓缩所述超敏蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种使用短短芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)作为宿主菌，发酵培养生产超敏蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤，(1)将所述超敏蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中，(2)将插入了所述超敏蛋白的质粒转入短短芽孢杆菌宿主中，(3)发酵培养所述短短芽孢杆菌，(4)自发酵液中分离浓缩所述超敏蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的超敏蛋白为来源于菌株Erwiniaamylovora的GeneBank编号为M92994.3的harpinEa蛋白；步骤(1)所述的质粒为pNC-hisT质粒。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的将质粒转入短短芽孢杆菌宿主中的方法为电击转化方法。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的发酵培养的培养条件为：T2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h，优选的，所述发酵培养条件是：T2培养基、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜，
申请(专利权)人：刘胜，
类型：发明
国别省市：湖北,42