一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，公开一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法，克隆的SlbHLH59基因的gDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，cDNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示，该基因包含功能突变位点的启动子序列如SEQ ID NO：4所示。本发明专利技术通过全基因组关联分析(GWAS)在番茄9号染色体定位到的转录因子SlbHLH59在调控番茄果实抗坏血酸积累方面具有显著的功能，同时该基因可以增强番茄对氧化逆境的抗性。因此，该基因可以在番茄品质改良，特别是在植物抗氧化等方面进行应用。

SlbHLH59 Gene and Its Application Method for Regulating Ascorbic Acid Content in Tomato Fruits

The invention belongs to the field of plant genetic engineering technology, and discloses a SlbHLH59 gene and its application method for regulating ascorbic acid content in tomato fruit. The gDNA sequence of the cloned SLBHLH59 gene is shown in the sequence table SEQ ID NO:1, the DNA sequence is shown in the sequence table SEQ ID NO:2, the protein sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO:3, and the gene contains the Enlightenment of functional mutation sites. The motions are shown in SEQ ID NO:4. The transcription factor SlbHLH59 located on chromosome 9 of Tomato by genome-wide association analysis (GWAS) has significant function in regulating ascorbic acid accumulation in tomato fruit, and the gene can enhance the resistance of tomato to oxidative stress. Therefore, the gene can be used in tomato quality improvement, especially in plant antioxidant and other aspects.

【技术实现步骤摘要】
一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法
本专利技术属于植物基因工程
，尤其涉及一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：抗坏血酸(L-ascorbicacid,AsA)，又称维生素C，是一种水溶性小分子还原性物质，是植物和大多数动物体内合成的一种己糖内酯化合物，对保护人类的身体健康和疾病预防有着重要的作用。AsA可以清除人体内产生的活性氧自由基，从而可以预防癌症；可以降低血液中胆固醇的含量，从而可以预防和治疗高血压、中风等疾病；可以阻止致癌物亚硝酸铵的形成，因此可以预防和降低癌症的发病率；可以作为参与人体表观修饰酶的辅因子，从而调控细胞铁的吸收；能够增强造血干细胞功能，抑制白血病发生。由于人体及灵长类动物丧失了自身合成抗坏血酸的能力，新鲜的蔬菜与水果是人类日常抗坏血酸的天然摄入来源。AsA在植物中也具有重要的作用，例如清除植物体内的活性氧(ROS)，充当一些酶的辅酶，影响细胞有丝分裂、细胞膨大以及提高植物的抗逆性等。基于AsA对人体健康和植物生长发育都有重要影响，以及科学研究技术的不断发展，对抗坏血酸的研究越来越受到重视。植物抗坏血酸的合成途径一直不是很清楚，直到1998年，结合同位素示踪、生化分析及早期的研究结果，才提出了植物中抗坏血酸合成的第一条途径，即D-甘露糖/L-半乳糖途径。随后其他的合成途径也陆续被提出，主要有半乳糖醛酸途径、古洛糖途径和肌醇途径。其中甘露糖/半乳糖途径中的基因在拟南芥及番茄等植物中基本上被鉴定和克隆，其它三条途径中的关键基因也被鉴定和克隆。另一方面，从EMS化学诱变处理的拟南芥材料中筛选出对臭氧敏感及抗坏血酸含量降低的拟南芥突变体，这些突变体为解析植物抗坏血酸合成途径起到了关键的作用。目前，关于AsA生物合成的调控途径研究较少，相关调控因子的克隆和鉴定主要集中在拟南芥等模式植物中。近期，在番茄中鉴定了一个调控AsA合成的转录因子SlHZ24，对AsA生物合成途径多个基因同步调控，而最终增加AsA含量。此外，还发现超量表达SlHZ24转基因株系对氧化逆境的抗性提高。由于转录调控具有强表达效应和多点协同调控效应，因此在基础研究及应用研究中这种调控越来越受到重视。bHLH(basichelix-loop-helix)转录因子是一种普遍存在于动植物中的转录因子家族,是植物中第二大转录因子家族,具有重要的生物学功能。目前，报道的植物基因组中bHLH转录因子数目已远超动物的bHLH转录因子数量，其中,重要农作物中发现的bHLH转录因子已超过630个。利用基因组学、生物信息学等方法，前人在番茄基因组中共鉴定了159个bHLH转录因子。bHLH结构域是由50-60个氨基酸组成的一个保守结构域，可分为长度为10-15个氨基酸的碱性氨基酸区和40个氨基酸左右的α-螺旋-环-α-螺旋区(HLH区)。碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N端，具有DNA识别和结合位点。植物中50％以上的碱性氨基酸区含有高度保守的His5-Glu9-Arg13序列，其对bHLH和靶标DNA的结合必不可缺。大多数bHLH转录因子通过识别和结合下游基因启动子区的E-box元件(一种有6个碱基排列的特殊回文序列，CANNTG)，进而激发基因进行转录。相对于bHLH转录因子庞大的总数,真正详细研究功能的基因则很少。植物bHLH转录因子在植物的生长发育、抗逆性和信号转导等方面发挥着重要作用。近年来，相关报道证明了bHLH转录因子参与调节植物类黄酮、生物碱和萜类等生物活性分子的生物合成途径，但是在调控植物AsA合成方面中还鲜有报道。番茄是一种在全世界范围内普遍种植的蔬菜作物，番茄的成熟果实中AsA的含量较高，可为人类提供丰富的维生素C及其它营养物质。同时在科学研究上作为研究果实的一种模式植物，与其它果实植物相比，它的基因组较小，生长周期较短，且具有成熟的遗传转化体系，因此番茄具有极高的实际应用价值及理论研究意义。随着生活水平的提高，人们对园艺作物的选育不光追求产量，也更加注重品质。AsA的含量是衡量番茄品质高低的重要标准，但目前对园艺作物中AsA的调控机制的认识较少。综上所述，现有技术存在的问题是：相对于拟南芥等模式植物而言，目前对园艺作物中AsA的调控机制的认识和研究较少，主要原因在于目前园艺作物例如番茄中并没有系统的基因突变体库，AsA相关突变体的发掘和鉴定没有拟南芥等模式植物成熟。因此，材料的匮乏限制了园艺作物AsA相关功能基因的挖掘。现有技术中，不能利用传统的双亲群体进行QTL定位。在调控植物AsA合成方面中还鲜有报道。解决上述技术问题的难度和意义：难度在于：AsA作为一个初级代谢性状，属于微效多基因调控的复杂性状，利用传统的双亲群体进行QTL定位也存在一定的难度。解决上述问题后带来的意义：本专利技术通过对302份番茄核心种质成熟果实进行代谢组分析，鉴定了一批AsA含量显著差异的番茄材料，丰富了番茄品质种质资源库。相对于传统的QTL定位，GWAS能更加有效的鉴定数量性状的遗传调控位点。因此，本专利技术克服现有材料和技术的缺点，通过对AsA变异丰富的自然群体进行GWAS分析，鉴定了AsA的主效调控基因SlbHLH59。通过对SlbHLH59基因的变异研究不仅有助于选择对抗坏血酸积累更高效的天然变异，还可以进一步认识植物抗坏血酸合成代谢的进化规律和调控机制，对于研究高品质番茄选育和番茄的栽培环境改良具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有的技术缺陷，提供一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法。本专利技术通过全基因组关联分析获得一个调控番茄果实抗坏血酸积累的重要基因SlbHLH59，该基因启动子中的一个关键的插入/缺失(片段命名为indel_8)片段是导致自然群体中抗坏血酸差异的主要原因。通过在番茄中超量表达SlbHLH59能够提高番茄果实中抗坏血酸的含量。并且本专利技术中的InDel_8可作为高抗坏血酸品种的分子标记。本专利技术是这样实现的，一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因，所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因gDNA序列为：SEQIDNO：1。进一步，所述的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因cDNA序列为SEQIDNO：2。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因编码的蛋白质，所述蛋白质的编码区氨基酸序列为：SEQIDNO:3。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因插入/缺失获得的分子标记，所述分子标记的多态性位点为indel_8，核苷酸序列为：SEQIDNO:4。本专利技术的另一目的在于提供一种所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因在调控番茄果实中抗坏血酸含量的应用方法，所述SlbHLH59基因在调控番茄果实中抗坏血酸含量的应用方法包括：步骤一：选取302份番茄核心种质红熟果实，利用其代谢物的GC-MS测定数据和4.2M重测序获得的SNP数据，采用全基因组关联分析从番茄中克隆获得SlbHLH基因，命名为SlbHLH59；所述分子标记为启动子；步骤二：根据SlbHLH59基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因，其特征在于，所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因gDNA序列为：SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因，其特征在于，所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因gDNA序列为：SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因，其特征在于，所述的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因cDNA序列为SEQIDNO：2。3.一种利用权利要求1所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的编码区氨基酸序列为：SEQIDNO:3。4.一种利用权利要求1所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因插入/缺失获得的分子标记，其特征在于，所述分子标记的多态性位点为indel_8，核苷酸序列为：SEQIDNO:4。5.一种如权利要求1所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因在调控番茄果实中抗坏血酸含量的应用方法，其特征在于，所述SlbHLH59基因在调控番茄果实中抗坏血酸含量的应用方法包括：步骤一：选取302份番茄核心种质红熟果实，利用其代谢物的GC-MS测定数据和4.2M重测序获得的SNP数据，采用全基因组关联分析从番茄中克隆获得SlbHLH基因，命名为SlbHLH59；所述分子标记为启动子；步骤二：根据SlbHLH59基因启动子和编码区中的突变位点，分别设计瞬时表达实验和转基因实验，确定功能突变位点；所述SlbHLH59基因的gDNA序列为SEQIDNO:1，包含4025个碱基对：cDNA序列为SEQIDNO:2，包含909个碱基对；编码区氨基酸序列为SEQIDNO:3，包括302个氨基酸；启动子序列为SEQIDNO:4，包含8个碱基的插入/缺失。6.一种利用权利要求4所述分子标记在调控番茄果实抗坏血酸含量的应用方法，其特征在于，所述分子标记在调控番茄果实抗坏血酸含量的应用方法包括：步骤A：对SlbHLH59...

【专利技术属性】
技术研发人员：张余洋，叶杰，叶志彪，李汉霞，张俊红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42