检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其方法。所述试剂盒包括用于扩增H7基因的第一正向引物、第一反向引物和第一探针，以及用于扩增N9基因的第二正向引物、第二反向引物和第二探针；其中，所述第一正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二正向引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.6所示。该试剂盒可应用于临床即时快速检测H7N9禽流感病毒。

【技术实现步骤摘要】
检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其方法。
技术介绍
禽流感是一种严重危害人和动物健康的人兽共患传染病，由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起。人感染后引发重症肺炎、结膜炎、呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症等，禽类感染后体温迅速上升、食欲减少、下痢、共济失调、死亡等，是造成畜牧业重大损失的主要原因之一。该病在世界各国广泛流行，亚洲、非洲、澳大利亚、欧洲和南北美洲都有报道。禽流感不仅造成巨大的经济损失，而且严重威胁着人类健康，同时给旅游业造成毁灭性打击，也导致了地球生态环境进一步恶化，其较高的病死率、难以预测的局部流行以及持续不断出现的新发病例，给当前传染病防控带来了巨大难题，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，在我国被列为一类传染病，世界卫生组织(WHO)认为，该疾病可能是对人类潜在威胁最大的疾病之一，受到全世界的高度关注。由于禽流感病毒抗原变化等原因，导致人类对新型重配病毒认识不足和滞后，往往无法在其暴发流行早期快速检测病原体，导致诊断延迟造成感染者病情加重甚至危及生命，同时，受感染者对大多突变和新发的禽流感病毒无天然免疫力，以上原因导致病毒迅速扩散并使疫情急剧蔓延，因此，禽流感病原体的早期快速精准检测显得尤为重要。目前，禽流感病毒的检测方法较多，主要有病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断方法等，这些方法在禽流感病毒检测过程中发挥了重要作用，但也存在一些不足和缺点，比如仪器设备庞大、检测成本高、耗时长、前处理繁琐、需PШ实验室、对操作人员的专业性要求较高等，难以实现样本的快速精准检测需求，更无法在禽流感暴发流行早期快速检测病原体。重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)技术是由Piepenburg等人于2006年首先提出，其反应主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶实现，首先，重组酶与上反向引物结合，寻找同源的双链DNA，一旦定位，发生链交换，单链绑定蛋白(SSB)与亲本链绑定，阻止其与脱离的模板链发生相互作用，然后，DNA聚合酶从上反向引物的3’端启动模板合成，形成两条双链DNA，如此循环重复进而实现扩增。整个反应体系由噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、寡核酸引物、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、缓冲液等组成。RPA与PCR不同，不需复杂的反应过程，可在37℃～39℃恒定温度下，反应20min左右即可完成扩增。RPA可结合侧向流动免疫层析技术，快速检测病原微生物，主要利用带生物素标记的引物和带羧基荧光素(FAM)标记的探针与靶核酸进行扩增反应，使最终扩增产物同时携带FAM和生物素标志。侧流层析试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体－核酸－纳米金粒三元复合体并显色，而未杂交的FAM标记探针形成不含生物素的两元复合物，结合在含抗FAM的质控线上不显色。在设计RPA引物探针时，需要在反向引物5’端进行生物素标记，探针5’端荧光基团标记，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(THF)，THF即四氢呋喃可被nfo核酶识别、切割，在DNA聚合酶作用下延伸，最后形成同时带有荧光基团和生物素双标记的RPA扩增产物，将扩增产物通过层析膜扩散，可被生物素配体和荧光基团标记的抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该检测方法耗时短，10min左右就能目测结果，肉眼判读。与PCR反应不同，RPA技术尚属起步研究阶段，引物、探针的设计无专门的软件，全依据RPA技术原理进行摸索筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其方法，旨在解决现有禽流感病毒检测成本高、耗时长，难以实现样本的快速精准检测的技术问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供一种检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增H7基因的第一正向引物、第一反向引物和第一探针，以及用于扩增N9基因的第二正向引物、第二反向引物和第二探针；所述第一正向引物、第一反向引物、第一探针、第二正向引物、第二反向引物和第二探针基于RPA技术设计；其中，所述第一正向引物的序列如SEQIDNO.1所示，所述第一反向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述第一探针的序列如SEQIDNO.3所示，所述第二正向引物的序列如SEQIDNO.4所示，所述第二反向引物的序列如SEQIDNO.5所示，所述第二探针的序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术另一方面提供一种检测H7N9禽流感病毒的方法，包括如下步骤：提取样品RNA；将所述样品RNA反转录为cDNA；将所述cDNA与本专利技术上述实施例的试剂盒中的试剂混合，进行RPA反应，得到反应液；将所述反应液加入到测流层析试纸条进行检测。本专利技术提供的用于检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，含有基于RPA技术设计的引物和探针组合，这些引物和探针经过多组优化、筛选得到，其具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，与H1N1、H3N2、H5N6和H9N2等其他亚型禽流感病毒无交叉反应，因此，该试剂盒可应用于临床即时快速检测H7N9禽流感病毒。本专利技术提供的用于检测H7N9禽流感病毒的方法，是基于RPA技术和侧流层析技术建立的快速检测H7N9禽流感病毒的方法，该方法既具有分子生物学检测的高灵敏度，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂昂贵的仪器设备，可在恒温条件下扩增、试纸条可视化检测，真正实现便携式的现场快速核酸检测，尤其适合于基层实验室和临床的H7N9禽流感病毒快速筛查检测。附图说明图1为本专利技术实施例2中H7基因的RPA引物、探针组的筛选结果图，其中：1为引物nfo-H7-F、nfo-H7-R和探针nfo-H7-P组，2为引物nfo-H7-F、nfo-H7-R1和探针nfo-H7-P组，3为nfo-H7-F、nfo-H7-R2和探针nfo-H7-P组；a为H7N9禽流感病毒cDNA，b为阴性对照；图2为本专利技术实施例2中N9基因的RPA引物、探针组的筛选结果图，其中1为引物nfo-N9-F、nfo-N9-R和探针nfo-N9-P组，2为引物nfo-N9-F、nfo-N9-R1和探针nfo-N9-P组，3为nfo-N9-F、nfo-N9-R2和探针nfo-N9-P组；a为H7N9禽流感病毒cDNA，b为阴性对照；图3为本专利技术实施例3中RPA-侧流层析检测H7N9禽流感病毒的有效性试验结果图，其中a为H7RPA反应液在侧流层析试纸条上的结果，b为N9RPA反应液在侧流层析试纸条上的结果，c为H7RPA反应液在侧流层析试纸条上1～10min内不同时间点的结果，d为N9RPA反应液在侧流层析试纸条上1～10min内不同时间点的结果；图4为本专利技术实施例3中RPA-侧流层析检测H7N9禽流感病毒的灵敏度试验结果图，其中a为H7不同稀释度RPA反应液在侧流层析试纸条上的结果，b为N9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增H7基因的第一正向引物、第一反向引物和第一探针，以及用于扩增N9基因的第二正向引物、第二反向引物和第二探针；所述第一正向引物、第一反向引物、第一探针、第二正向引物、第二反向引物和第二探针基于RPA技术设计；其中，所述第一正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二正向引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增H7基因的第一正向引物、第一反向引物和第一探针，以及用于扩增N9基因的第二正向引物、第二反向引物和第二探针；所述第一正向引物、第一反向引物、第一探针、第二正向引物、第二反向引物和第二探针基于RPA技术设计；其中，所述第一正向引物的序列如SEQIDNO.1所示，所述第一反向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述第一探针的序列如SEQIDNO.3所示，所述第二正向引物的序列如SEQIDNO.4所示，所述第二反向引物的序列如SEQIDNO.5所示，所述第二探针的序列如SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一反向引物的5’端和所述第二反向引物的5’端均连接有生物素，所述第一探针的5’端连接有第一荧光基团，所述第二探针的5’端连接有第二荧光基团。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一荧光基团和所述第二荧光基团均为FAM。4.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：马铈委，陆家海，原丽红，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44