本发明专利技术涉及大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法。多重PCR检测引物包括3对引物，分别扩增O157的rfbE、fliC、stx1基因，序列详见序列表所示。使用上述检测引物对大肠杆菌O157DNA进行多重PCR检测，设置阳性对照和阴性对照、空白对照，所述PCR扩增条件为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48‑52℃退火45s，72℃延长45s，共扩增循环30‑35个循环，最后72℃延伸5min。本发明专利技术的大肠杆菌O157检测引物、检测方法具有特异、灵敏的优点，可以实现对大肠杆菌O157的精准鉴定。
【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法
本专利技术涉及微生物分子生物学检测技术，特别是涉及大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法。
技术介绍
大肠杆菌(Escherichiacoli)是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌，直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜禽，常引起严重腹泻和败血症。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)。根据O抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多个血清型，其中16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泻和成人肋膜炎。大肠杆菌的血清型众多，鉴别困难。根据不同的生物学特性，将致病性大肠杆菌分为肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、大肠杆菌(EHEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠外致病性大肠杆菌等(EXEC)等。大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)是一类对人类致病的大肠杆菌，以引起肠道出血为特点，症状包括腹痛、血性腹泻、败血症、严重胃肠炎等，严重者可并发溶血性尿毒综合症，引起急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少甚至死亡。大肠杆菌也被称为产志贺毒素大肠杆菌或产志贺样毒素大肠杆菌。潜伏期为1-10日，通常为48-72小时。EHEC是重要的人畜共患性和食源性致病菌。EHEC感染或人食用了被污染的食品而发病，被WHO列为四大食源性致病菌之一，公共卫生和食品安全意义重大。美国CDC调查表明，每年约有70000人感染大肠杆菌病例。EHEC主要寄生在牛、羊等家畜和其它反刍动物体内。人主要通过食用被人畜粪便污染的食物，如烹煮不彻底的肉馅制品或未经消毒的牛奶、受粪便污染的水和蔬菜等被感染。EHEC是大肠杆菌的一个亚型，以O抗原分型，EHEC可分为O157、O26、O111、O104等血清型。O157：H7主要见于婴幼儿，以爆发流行性为主，美国在1982、1984、1993年曾三次发生O157:H7的爆发性流行。日本曾在1996年爆发过波及9000多人的大流行。2011年爆发于德国席卷欧洲的大肠杆菌O104:H4疫情导致约3000人发病，数十人死亡。大肠杆菌的毒力因子有菌毛(黏附素)、内毒素、荚膜、外毒素等，外毒素有志贺毒素、肠毒素(包括耐热毒素LT和不耐热毒素LT)等。O157的主要毒力因子有黏附因子(菌毛、外膜蛋白、紧密素等)、肠毒素(志贺毒素STX、溶血素、Ⅲ型分泌系统)等。对细菌鉴定方法有微生物分离培养法、形态观察法、生化反应、免疫学方法、分子生物学方法等。传统的微生物分离培养要经过增菌培养、选择培养、鉴别培养等步骤，操作繁琐，耗时长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，不能满足食源性微生物快速检测的需求。生化特性鉴定法和血清学鉴定法是基于表型特征进行鉴定的，但这些方法鉴定能力有限，区分度差，常因表型发生变异而导致鉴定失败，因此依据表型特征往往不能准确鉴定微生物，尤其是对血清型众多的大肠杆菌。如已发现山梨醇发酵阳性和β-葡糖醛酸糖苷酶活性阳性的大肠杆菌O157菌株，因此，不能通过不发酵山梨醇、缺乏β-葡糖醛酸糖苷酶活性的特征来特异鉴定大肠杆菌O157菌株。此外，沙门氏菌的N群、小肠结肠炎耶尔森氏菌等菌的菌体抗原也能与O157菌体抗原的抗体发生交叉反应，因此，也不能通过鉴定O157菌体抗原来特异鉴定大肠杆菌O157菌株。分子生物学检测法是基于核酸检测的方法，具有特异、灵敏等优点，能准确鉴定微生物的种属关系，在微生物的分类鉴定中应用广泛。该类方法又以PCR、多重PCR、荧光定量PCR、基因芯片等检测技术应用较广泛。已公开的检测EHECO157:H7的方法很多，包括PCR、荧光PCR等。这些方法均基于O157的志贺样毒素基因、溶血素基因hly和eae基因等。但许多非O157血清型的EHEC，如O26、O111、O91、O103、O146等血清型的大肠杆菌以及志贺氏菌、霍乱弧菌、枸橼酸杆菌等的部分菌株也具有志贺样毒素基因，因此，单纯使用一对志贺样毒素基因引物检测无法区分这些菌株与EPEC及EHEC的不同血清型。EPEC和EHEC的eae基因有高度的同源性。EHECO26、O111等也有溶血素基因hly，同样可以引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征，因此对eae、hly基因的鉴定也不能特异检测大肠杆菌O157:H7菌株。O157大肠杆菌具有多种鞭毛抗原，而许多非O157血清型菌株，尤其是大肠杆菌O55:H7菌株也有H7鞭毛基因fliC，因此fliC基因检测只能作为辅助检测手段用于大肠杆菌O157:H7菌株的鉴定。到目前为止还没有出现关于运用三重PCR鉴定EHECO157:H7菌株的报道。与现有的O157的PCR检测法比较，本专利技术使用三重PCR通过一次扩增O157的stx1、rfbE、fliC三个携带率最高的毒力基因，检测特异性比常规的检测其中一种或二种基因的PCR方法高，可用于O157的精准鉴定，不会发生错检和漏检的情况。
技术实现思路
为解决上述
技术介绍
中提到的大肠杆菌O157的鉴定耗时长、特异性差、灵敏度低等问题，本专利技术提供了一种检测灵敏度高的O157的多重PCR检测引物及检测方法。本专利技术是通过以下方式实现的：大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法，其特征在于包括3对引物，引物序列如下：rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQIDNo.1)，rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQIDNo.2)，fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQIDNo.3)，fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQIDNo.4)，stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQIDNo.5)，stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQIDNo.6)，设计多重PCR引物时应尽量避免引物二聚体、发卡结构的形成。上述引物是大肠杆菌O157的rfbE、fliC、stx1基因的保守区，所以引物能够识别所有的O157的rfbE、fliC、stx基因，因而能检测所有的大肠杆菌O157。大肠杆菌O157的多重PCR检测方法，其特征在于每25μLPCR反应体系中含有以下组分：10×PCRbuffer2.5ul，25mmol/LMgCl20.25-1.5μL，TaqDNA聚合酶1.25U，2.5mmol/LdNTPs2ul，DNA模版1-2ul，上下游引物各0.5-1ul，灭菌双蒸水补足体积至25ul。设阳性对照、阴性对照和空白对照(蒸馏水)。将上述PCR反应液添加到反应管中，置PCR仪中进行扩增，扩增程序为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48-52℃退火30s，72℃延长45s，共扩增循环30-35个循环，最后72℃延伸5min。反应结束后取PCR产物，在1-2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后将凝胶置紫外成像仪中观察结果。结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法，其特征在于包括3对引物，引物序列如下：rfbE上游引物F1：5’‑CGTAAGAGGGACCGTAGA‑3’(SEQ ID No.1)，rfbE下游引物F2：5’‑TGGCTGGATTATCGTTTG‑3’(SEQ ID No.2)，fliC上游引物F3：5’‑GCTGTCGAGTTCTATCGAG‑3’(SEQ ID No.3)，fliC下游引物F4：5’‑GTGACTTTATCGCCATTCC‑3’(SEQ ID No.4)，stx1上游引物F5：5’‑ACGAGGGCTTGATGTCTA‑3’(SEQ ID No.5)，stx1下游引物F6：5’‑GTAAGGCTTCTGCTGTGA‑3’(SEQ ID No.6)。
【技术特征摘要】
1.大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法，其特征在于包括3对引物，引物序列如下：rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQIDNo.1)，rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQIDNo.2)，fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQIDNo.3)，fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQIDNo.4)，stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQIDNo.5)，stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQIDNo.6)。2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜世敢，朱丽萍，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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