一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器制造技术

本发明专利技术提供一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系。本发明专利技术通过巧妙地设计引物、模板及探针，使得在锌离子存在下可对模板进行超快扩增，扩增产物通过促发HCR反应，使得产物在适宜环境中形成G四链体。进一步利用G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对锌离子的快速、可视化检测。不仅如此，本发明专利技术提供的传感器对锌离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。

【技术实现步骤摘要】
一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器
本专利技术涉及生物传感器
，具体地说，涉及一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。
技术介绍
锌，化学符号是Zn，原子序数是30，原子量是65.38，属第IIB族，是一种浅灰色的过渡金属，在自然界中分布较广，主要以硫化锌、氧化锌状态存在，也可与很多元素如铅、铜、锌的矿物共生。锌是人体含量最多的微量元素，其含量高达3g之多，主要以锌离子的形式参与体内的代谢，参与人体内200多种酶的合成与活化，是机体新陈代谢中必不可少的物质。锌污染是指锌及化合物所引起的环境污染。主要污染源有锌矿开采、冶炼加工、机械制造以及镀锌、仪器仪表、有机会合成和造纸等工业的排放。传统的锌离子检测方法一般可分为冷原子吸收光谱法、石墨碳原子吸收光谱法和火焰原子吸收光谱法等，但是普遍存在前处理复杂、大型仪器专人操作、检测周期长、价格昂贵的特征。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足金属离子的检测的需要，以保障食品的安全。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。本专利技术的另一目的是提供基于生物传感器技术检测锌离子的方法。为了实现本专利技术目的，专利技术人根据锌离子的特异性核酶，设计通用隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应(superPolymeraseChainReaction,sPCR)，结合富G序列在K+存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，构建了一种新型的基于隔断引物的锌离子切割型功能核酸比色传感器。第一方面，本专利技术提供一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系。所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系和HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链和酶链：底物链：5′-CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrA—GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-3′酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示锌离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：正向隔断引物：5′-AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC-隔断物-GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物：5′-GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-3′模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC-3′所述HCR体系包括2条探针：探针1：5′-AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT-3′探针2：5′-TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG-3′。其中，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。其它能够阻止PCR延伸的隔断结构也可用于本专利技术。所述DNA聚合酶为ExTaqDNA聚合酶，所述缓冲液为10×ExTaqBuffer，二者与所述dNTP均购自赛默飞科技(ThermoScientificLifeTechnologies)。本专利技术所述的检测体系包括：酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。其中，所述酶活缓冲液为：100mMTris、120mMNaCl、10mMMgCl2、100mMKCl，pH8.4。所述氯高铁血红素溶液为20mM的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2μL：1mL的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。本专利技术还提供前述传感器在检测锌离子方面中的应用，所述检测可表现为定性检测或定量检测。第二方面，本专利技术提供了一种利用前述传感器对锌离子进行定性检测的方法，包括如下步骤：S1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；S2、将S1所得切割产物加入所述sPCR扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得sPCR产物；S3、将所述sPCR产物加入所述HCR体系中进行HCR反应，得HCR产物；S4、利用所述检测体系对所述HCR产物进行检测。S1具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μM-2μM，85℃-95℃加热15min，然后降温至25-37℃，得到核酶液；向35μL所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μL体系，于36-38℃孵育4-6min，然后加入4-6μL终止液，得到切割产物。进一步地，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和HCR产物按体积比为8:1:1混匀(总体积为100μL)，在35-38℃条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的ABTS显色液，混匀，35-38℃避光孵育，肉眼进行监测。第三方面，本专利技术提供了一种利用前述传感器对锌离子进行定量检测的方法，包括如下步骤：SI、制作标准曲线：利用已知浓度的锌离子溶液，构建具有不同锌离子浓度的切割体系，sPCR扩增、HCR反应与检测步骤与前述定性检测的步骤相同；以锌离子浓度为横坐标，以OD415值为纵坐标，绘制标准曲线；SII、按照前述定性检测方法对待测样品进行检测，将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中锌离子的含量，实现对锌离子的定量检测。本专利技术提供一种基于生物传感器技术检测锌离子的方法，首先设计锌离子特异性核酶，包括底物链和酶链，将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性锌离子切割活性的核酶，当锌离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段作为反向引物(即目标引发分子)，与正向隔断引物一起对模板进行PCR扩增反应，所得PCR产物的一端带有一段单链核酸序列；所述PCR产物在K+存在条件下，形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对锌离子的快速可视化检测；或者通过PCR产物促发HCR反应，使得HCR产物在K+存在条件下形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对锌离子的快速可视化检测。本专利技术中，显色液可用TMB替代。所述底物链和酶链的碱基序列如下：底物链：5′-CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrA—GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-3′酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示锌离子切割位点；所述正向隔断引物的5′端具有发夹结构，两段反向互补碱基序列之间至少设有一阻断物，所述阻断物可阻断PCR延伸。优选地，所述正向隔断引物的发夹结构上具有富G碱基序列。当所述正向隔断引物的发夹结构上设计有富G碱基序列时，则无需借助HCR反应，即可实现对锌离子的快速可视化检测。前述的方法，HCR的反应体系中至少含有一条带发夹结构的探针，所述发夹结构的碱基组成与所述正向隔断引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，其特征在于，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系；所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系和HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链和酶链：底物链：5′‑CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrA—GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG‑3′酶链：5′‑TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC‑3′其中，rA表示核糖核酸；‑表示锌离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：正向隔断引物：5′‑AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC‑隔断物‑GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC‑3′反向引物：5′‑GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG‑3′模板：5′‑TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC‑3′所述HCR体系包括2条探针：探针1：5′‑AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT‑3′探针2：5′‑TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG‑3′。...

【技术特征摘要】
1.一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，其特征在于，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系；所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系和HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链和酶链：底物链：5′-CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrA—GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-3′酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示锌离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：正向隔断引物：5′-AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC-隔断物-GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物：5′-GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-3′模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC-3′所述HCR体系包括2条探针：探针1：5′-AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT-3′探针2：5′-TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG-3′。2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述检测体系包括：酶活缓冲液和氯高铁血红素溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，罗云波，黄昆仑，杜再慧，田晶晶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11