The invention relates to a Salmonella typing method based on PCR DGGE technology. First, extract the DNA of the test sample and carry out the sample number; secondly, amplify the sample with primer GC rpoB1/rpoB3R by taking the genomic DNA of the sample as template; (3) analysis of the PCR product by denaturing gradient gel electrophoresis; and the recovery and measurement of the dominant bands in DGGE map. After sequencing, the positive clones were sequenced, and the phylogenetic tree was constructed by MEGA5 software and Neighbor joining joining method. PCR DGGE technology has the advantages of rapid, simple and reproducible isolation, avoiding the analysis errors caused by isolation, purification and culture. It can directly reproduce the flora structure by fingerprint, and identify the species by sequence analysis or by unique probe hybridization. It is a fast and efficient pathogenic microorganism. Methods for typing and testing.
【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR-DGGE技术的沙门氏菌分型方法
本专利技术属于基因领域,尤其是一种基于PCR-DGGE技术的沙门氏菌分型方法。
技术介绍
食品种类繁多,富含丰富的营养物质。它是微生物生长繁殖的天然培养基。因此对食品中复杂的混合微生物群落进行及时监测和准确鉴定变得越来越重要。传统微生物检测方法主要是依赖于富集培养、选择性分离、菌落计数和生化鉴定等方法,检测步骤繁琐、培养时间长、工作量大、检出率及灵敏度不高,容易出现假阴性。而以PCR(polymerasechainreaction)技术为主的一些分子生物学检测技术因具有快速、灵敏的特点,正逐渐取代传统检测方法成为食品安全监督的有力工具。如变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis,DGGE)技术是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化,从而将片段大小相同但碱基排列不同的DNA片段分开,从而了解微生物的分布情况。它是研究微生物群落组成及亲缘关系的主要分子生物学检测技术之一,是研究微生物群落组成分析的重要技术,DGGE技术不依赖于培养过程,缩短了样品分析时间,能显示环境样品中不可培养微生物的遗传信息。近年来,食源性病原菌污染食品引起的食源性疾病逐年呈上升趋势,引起了人们的广泛关注。由于食源性致病菌的广泛空间性、时间性复杂因子的存在,一直难以得到及时有效的监控。不仅对食品安全卫生和人民健康构成严重威胁,也对食品工业和国民经济造成很大的影响。因此迫切需要深入了解主要食源性致病菌的生物学特性和致病机理,控制致病菌的危害,切断其感染途径,对食品安 ...
【技术保护点】
1.一种基于PCR‑DGGE技术的沙门氏菌分型方法,其特征在于:步骤如下⑴提取供试样品的DNA,并进行样品编号;⑵以样品基因组DNA为模板,采用引物GC‑rpoB1/rpoB3R扩增样品;⑶PCR产物的变性梯度凝胶电泳分析;取10μL PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳分析,采用变形梯度为35%~55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中100V 60℃下电泳15小时;然后染色;⑷DGGE图谱中优势条带的回收与测序用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带,采用OMEGA公司Poly‑Gel DNA Extraction Kit回收目的条带;⑸DGGE凝胶条带回收后,以rpoB1F/rpoB3R为引物进行PCR扩增。PCR产物纯化后连接到pMD18‑T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆测序。⑹采用MEGA5软件,Neighbor‑joining法构建系统发育树,自展数(bootstrap)为1000,根据测序结果进行比对,鉴定样品分型。
【技术特征摘要】
1.一种基于PCR-DGGE技术的沙门氏菌分型方法,其特征在于:步骤如下⑴提取供试样品的DNA,并进行样品编号;⑵以样品基因组DNA为模板,采用引物GC-rpoB1/rpoB3R扩增样品;⑶PCR产物的变性梯度凝胶电泳分析;取10μLPCR的产物进行变形梯度凝胶电泳分析,采用变形梯度为35%~55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中100V60℃下电泳15小时;然后染色;⑷DGGE图谱中优势条带的回收与测序用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带,采用OMEGA公司Poly-GelDNAExtractionKit回收目的条带;⑸DGGE凝胶条带回收后,以rpoB1F/rpoB3R为引物进行PCR扩增。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,筛选阳性...
【专利技术属性】
技术研发人员:杨向莹,张捷,谢雪钦,张琦慧,石嵩,畅晓晖,陈广全,
申请(专利权)人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心,
类型:发明
国别省市:北京,11
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